解整合素—金属蛋白酶33(ADAM33)在哮喘气道重塑中的作用研究

来源 :第二军医大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:martelfeng
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第一部分哮喘患者血清ADAM33的表达水平及其与哮喘严重程度、气流受限和气道慢性炎症的关系目的通过检测不同严重程度哮喘患者血清中ADAM33的表达水平,并将其与肺功能FEV1%以及气道炎症指标IL-4、IL-13、TGF-β1、血清总IgE和外周血嗜酸性粒细胞(Eosinohphils,Eos)计数并进行相关性分析,初步评估ADAM33参与哮喘气道重塑的可能机制。方法纳入2015年5月至2016年5月期间于我院就诊的轻-中度哮喘、重度哮喘和健康对照组患者,分别检测肺功能FEV1%和血清中ADAM33的表达水平和血总IgE水平、Eos计数、IL-4、IL-13和TGF-β1的表达水平并进行相关性分析。结果重度哮喘组、轻-中度哮喘组和健康对照组血清中ADAM33表达分别为64.8±12.8 pg/mL、23.8±6.21 pg/mL和18.3±4.49 pg/mL,重度哮喘组和轻-中度哮喘组血清ADAM33表达均显著高于健康对照组,且重度哮喘组血清ADAM33表达也同样高于轻-中度哮喘组(均p<0.05),差别有统计学意义。与Pearson直线相关分析显示ADAM33表达与FEV1%呈负相关,与IL-4、IL-13和TGF-β1水平呈正相关性,而与Eos计数和血清总IgE无相关性。结论重度哮喘患者外周血清中ADAM33表达上调,且表达水平与哮喘严重程度成正比。相关性分析显示哮喘外周血ADAM33表达水平与IgE、Eos粒细胞计数无明显关系,与肺功能FEV1%呈负相关,与IL-4、IL-13和TGF-β1水平呈正相关,提示血清ADAM33可能参与哮喘的气道重塑过程。第二部分HDM对16-HEB细胞中ADAM33表达和上皮细胞-间质转化的影响目的以屋尘螨提取液(House dust mite extracts,HDM)刺激人支气管上皮细胞16-HBE,通过检测过敏原对16-HBE细胞中ADAM33表达水平以及上皮细胞-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)改变的影响,评估过敏原哮喘中ADAM33表达与气道重塑中EMT的关系。方法16-HBE细胞分为HDM(10 ng/m L)组,TGF-β1(10 ng/m L)组、HDM+TGF-β1(各10 ng/mL)组和阴性对照(含1%FCS的DMEM培养液)组。培养72 h后200×光镜下观察细胞形态,CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力,Western blot法检测E-钙黏蛋白(E-cadherin);波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达。结果HDM单独不能刺激16-HBE细胞增殖和发生纤维样细胞形态改变,对EMT相关蛋白Vimentin和α-SMA的表达无明显影响,但减少了E-cadherin蛋白的表达而降低细胞间粘附。HDM与TGF-β1共同作用则明显促进了16-HBE细胞增殖和发生纤维样细胞形态改变,减少了E-cadherin蛋白,增加了Vimentin和α-SMA的表达。结论HDM单独能通过减少16-HBE细胞表达E-cadherin而减低细胞间粘附力,并不能诱导发生EMT改变;与TGF-β1共同作用则明显促进TGF-β1诱导的16-HBE细胞EMT改变。第三部分TGF-β1对16-HBE细胞中ADAM33表达的影响及其与TGF-β1诱导的上皮细胞-间质转化的关系研究目的观察TGF-β1对人气道上皮细胞(16-HBE)中ADAM33表达的影响,以及ADAM33表达水平与TGF-β1诱导的上皮细胞-间质转化(EMT)的关系,探索ADAM33参与哮喘气道重塑的可能机制。方法以不同浓度的TGF-β1(10、20和30 ng/mL)刺激后观察细胞形态变化,Western Blot和RT-PCR法检测ADAM33和EMT相关蛋白(E-cadherin和Vimentin)和mRNA表达变化。结果不同浓度的TGF-β1均可刺激16-HBE细胞由椭圆形贴壁形态转化成纺锤体型的成纤维细胞样形态改变,在浓度为20 ng/mL时即达到最明显。不同浓度的TGF-β1均上调ADAM33和Vimentin蛋白和mRNA表达,下调E-cadherin表达,且ADAM33蛋白表达与E-cadhein呈显著的负相关(R~2=0.935,P<0.05),而与Vimentin呈正相关(R~2=0.425,P<0.05)。结论TGF-β1可能通过促进16-HBE细胞表达ADAM33而促进哮喘气道重塑中的上皮细胞-间质转化改变。第四部分气道上皮细胞过表达ADAM33对TGF-β1诱导的上皮细胞-间质转化的影响目的通过构建Ad-ADAM33腺病毒载体转染16-HBE细胞,观察ADAM33表达水平上调对TGF-β1诱导的上皮细胞-间质转化(EMT)的影响,探索ADAM33参与哮喘气道重塑的可能机制。方法构建Ad-ADAM33腺病毒载体,筛选最佳MOI值转染16-HBE细胞,将细胞分为空白对照组(不转染腺病毒),阴性对照组(转染空病毒)和阳性表达组(转染Ad-ADAM33重组腺病毒),以20 ng/mL浓度的TGF-β1刺激24、48和72h后分别通过Western blot和RT-PCR法检测EMT相关蛋白(E-cadherin和Vimentin)和mRNA表达变化。结果成功构建Ad-ADAM33腺病毒,筛选转染最佳MOI值为1500,转染16-HBE细胞后western blot检测ADAM33蛋白表达明显升高。以20 ng/mL浓度的TGF-β1刺激24、48和72 h后,RT-PCR检测发现于三个时间段阴性对照组细胞E-cadherin和Vimentin mRNA表达较空白对照组无明显变化,差异无统计学意义(均p<0.05),但Ad-ADAM33-EGFP组细胞E-cadherin mRNA表达较空白对照组和阴性对照组明显降低,而Vimentin mRNA明显升高,差异均有统计学意义(均p<0.05)。在western blot检测发现Ad-ADAM33-EGFP组细胞E-cadherin蛋白表达较空白对照组和阴性对照组明显降低,Vimentin蛋白表达明显升高,差异均有统计学意义(均p<0.05)。结论人支气管上皮细胞中ADAM33的表达上调可以促进TGF-β1诱导的上皮细胞-间质转化改变。
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