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鱼类养殖在我国水产养殖业中具有举足轻重的地位,但日益频发的病害问题严重制约了鱼类养殖业的可持续发展。目前产业上迫切需要有效的病害防治技术保障水产品质量安全。对鱼类免疫机理的深入研究是实现这一目标的根本途径。半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国重要的海水养殖鱼类,目前养殖产值达到10亿元之多,但是细菌性和病毒性病害对半滑舌鳎养殖业造成严重威胁,由于对半滑舌鳎抗菌和抗病毒免疫防御机理不清楚,缺乏有效病害防治措施。通过半滑舌鳎转录组数据中抗病组、染病组和健康组的Cs C8基因和CsSHP-1的表达量存在显著差异,而且鉴于此CsC8基因和CsSHP-1在半滑舌鳎免疫系统中的重要性,本研究以半滑舌鳎为研究对象,对CsC8基因和CsSHP-1基因进行克隆鉴定、重组表达及功能分析,阐明半滑舌鳎抗病分子机制,为半滑舌鳎的病害防治提供重要理论基础。具体研究结果如下:对半滑舌鳎CsC8基因进行了克隆和验证,结果发现半滑舌鳎补体Cs C8由CsC8α、CsC8β和CsC8γ3条链组成,分别由CsC8α、CsC8β和CsC8γ编码,其中CsC8α基因包含了1797 bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF),编码598个氨基酸,CsC8β基因包含了1749 bp的开放阅读框,编码582个氨基酸,CsC8γ基因包含了666 bp的开放阅读框,编码221个氨基酸。将CsC8α、CsC8β和CsC8γ的基因比对半滑舌鳎基因组,发现CsC8α和CsC8β位于20号染色体上,而CsC8γ位于第3号染色体上,并不是线性分布的。CsC8α、CsC8β和CsC8γ在13种健康组织中的表达情况显示,CsC-8α、CsC8β和CsC8γ在不同组织中均有表达,其中肝脏中表达量最高,其次是脾脏和卵巢;感染鳗弧菌后,CsC8α基因在6种免疫组织中整体均表现出上调表达趋势,不同组织对鳗弧菌的敏感度不同,Cs C8α基因在不同组织的表达量峰值出现的时间点也不同,其中肝脏(48h)、血液(48h)、脾脏(12h)、肠(12h)、头肾(24h)和鳃(6h),而且CsC8α在血液中表达量变化最明显,48h时的表达量达到0h的119.3倍(P<0.01);CsC8β基因在6种免疫组织中整体表现出上调表达趋势,CsC8β基因在肝脏、脾脏和鳃中都是在24h出现表达的最高,在肠中是在6h出现表达的最大值,表现出组织敏感性,在血液中出现了反常,在6h和24h表达上调后开始下调,但在72h出现表达的峰值,在头肾中,12h和48h表达量达到峰值,而且CsC8β在头肾中表达量变化最为明显,12h的表达量为0h的17.8倍(P<0.01);CsC8γ基因在6种免疫组织中整体表现出上调表达趋势,CsC8γ基因在肝脏、头肾、脾脏、肠和鳃中都是在12h出现表达的最高峰,在血液中,CsC8γ的表达量变化最为明显,72h的表达量为0h的48.3倍(P<0.01)。重组蛋白CsC8α体外抑菌实验结果显示,重组蛋白CsC8α对鳗弧菌的抑制效果最为明显,抑菌率随着重组蛋白浓度的增加明显升高;对爱德华氏菌和副溶血弧菌的抑菌效果明显弱于对鳗弧菌的抑菌效果,但也表现出了一定的抑菌作用;当重组蛋白浓度超过0.3mg/ml后,也只达到0.5以上;对于革兰氏阳性菌的代表菌株金黄色葡萄球菌,重组蛋白对其抑菌效果不明显,抑菌率一直在0.5以下,在最高浓度0.5mg/ml时抑菌率才达到0.43,得不到明显的抑菌效果。上述结果表明,半滑舌鳎补体基因C8在免疫应答反应中发挥重要作用,尤其是对细菌性病原菌引起的免疫反应和对革兰氏阴性菌的抑制作用。通过RACE和PCR技术获得半滑舌鳎CsSHP-1基因的cDNA全长,CsSHP-1的cDNA全长2045bp,编码区共包含1743bp,控制编码580个氨基酸。SMART结构域预测分析得知CsSHP-1基因共包含2个SH2结构域,1个PTPc结构域;通过氨基酸多序列比对结果显示,半滑舌鳎SHP-1与尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus的相似度最高,达到82%;系统进化树显示鱼类的SHP-1首先聚为一支然后再与高等脊椎动物聚在一起。CsSHP-1基因在13种健康组织中的表达分析显示,半滑舌鳎CsSHP-1在各个组织中均有表达,在脾脏中的表达量最高,心脏中的表达最低;感染鳗弧菌后在6种免疫组织肝、脾、小肠、头肾、鳃、血液中均出现不同程度的上调表达,但是峰值出现的时间点不同;用4种病原模拟物处理半滑舌鳎外周血淋巴细胞后,除PolyI:C处理后表达量呈现持续下调趋势外,其他实验组出现上调表达趋势,但不是很明显。为了进一步探究CsSHP-1的功能,本研究在毕赤酵母真核表达系统成功表达出分子量为67kDa的重组CsSHP-1,用CCK-8法测试重组蛋白CsSHP-1对人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549和人乳腺癌细胞MDA-MB-231三种癌细胞的体外细胞毒活性及强度。结果显示:重组蛋白CsSHP-1对3种癌细胞均有不同程度的细胞毒活性,其细胞毒活性强度顺序为:人肝癌细胞HepG2>人乳腺癌细胞MDA-MB-231>人肺癌细胞A549。综上所述:半滑舌鳎免疫相关基因C8和SHP-1在免疫应答中发挥着作用,对其免疫机理的研究为更加全面的了解半滑舌鳎免疫机制奠定理论基础。