目的探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达在骨肉瘤侵袭、转移中的作用以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑霉素A(trichost- atin A,TSA)体外抗骨肉瘤的活性及作用机制,为骨肉瘤的治疗提供一条新的途径和策略。方法1.免疫组化法检测HIF-1α在骨肉瘤组织中的表达及与临床病理学参数的关系。收集39例具有完整随访资料的骨肉瘤患者的组织石蜡标本及部分瘤旁组织,通过免疫组化方法检测HIF-1α、VEGF和MVD在骨肉瘤组织中的表达,将表达结果与患者的临床病理学参数进行统计分析;取15例新鲜骨肉瘤组织标本,通过RT-PCR的方法,检测组织中HIF-1α及VEGF的mRNA表达。从中了解HIF-1α表达与血管生成的关系及其在预后预测中的意义。2.体外细胞培养研究TSA对骨肉瘤MG-63细胞增殖、凋亡、细胞周期及侵袭性的影响。体外培养骨肉瘤MG-63细胞,用TSA处理,通过直接镜观、MTT、流式细胞仪、Annexin V、TUNEL、电镜及Transwell法等手段,了解TSA对骨肉瘤细胞的形态、增殖、细胞周期、凋亡及侵袭性的影响,探讨其体外抗骨肉瘤的活性。3.体外细胞培养低氧诱导骨肉瘤MG-63细胞HIF-1α的mRNA及蛋白表达,以及TSA对其表达的影响。体外细胞培养骨肉瘤MG-63细胞株,去铁胺(desferrioxamine,DFX)模拟低氧环境,采用RT-PCR、Western blotting、ELISA等方法,检测低氧诱导MG-63细胞HIF-1α及其靶基因VEGF的mRNA、蛋白表达;同时给予TSA处理,了解低氧条件下TSA对骨肉瘤MG-63细胞HIF-1α表达的影响以及TSA抗肿瘤血管生成的作用。从低氧诱导HIF-1α表达及血管生成角度探讨骨肉瘤的侵袭、转移机制。结果1.骨肉瘤组织中HIF-1a阳性表达主要定位于细胞核,着色呈棕黄色颗粒。HIF-1a在骨肉瘤组织中过表达。39例骨肉瘤中,阴性表达8例(20.5%),弱阳性表达14例(35.9%),中等阳性表达9例(23.1%),强阳性表达8例(20.5%),总阳性表达率79.5%,与瘤旁非肿瘤组织比较差异具有显著意义(P<0.05)。HIF-1a在骨肉瘤组织内部以及坏死区域的周围、远离血管区等明显缺氧区域表达明显,提示HIF-1a的表达与组织低氧密切相关。VEGF阳性表达主要定位于肿瘤细胞的细胞质及细胞膜上。39例骨肉瘤中,阴性表达4例(10.3%),弱阳性表达16例(41%),中等阳性表达11例(28.2%),强阳性表达8例(20.5%),总阳性表达率89.7%,与瘤旁组织相比,两者差异具有显著意义(P<0.05)。39例骨肉瘤组织,MVD平均计数为29.92±5.2,明显高于瘤旁组织12.41±3.7(P<0.05)。连续切片显示HIF-1a、VEGF、CD31三者在骨肉瘤组织中的表达区域基本一致。Spearman相关分析表明HIF-1a、VEGF的阳性表达与MVD正相关。提示HIF-1a阳性表达与肿瘤血管的形成密切相关。HIF-1a的过表达与肿瘤分期(ⅡA VSⅡB/Ⅲ)及肿瘤坏死率(<90% VS≥90%)显著相关,具有统计学意义(P<0.05)。单因素统计分析,外科分期(ⅡA VSⅡB/Ⅲ)、肿瘤细胞坏死率(<90% VS≥90%)、HIF-1a的表达(阴性/弱阳性VS中等/强阳性)影响患者的无瘤生存期(disease-free survival, DFS)及总生存率(overall survival, OS)(P<0.05,P<0.05,P<0.001)。多因素COX回归分析,外科分期和肿瘤细胞坏死率对DFS、OS具有明显的统计学意义(分别为P=0.015,P=0.041,P=0.017,P=0.031)。而HIF-1 a表达对DFS、OS无统计学意义。Kaplan–Meier生存分析,HIF-1a的表达(阴性/弱阳性VS中等/强阳性)显著影响骨肉瘤患者的OS和DFS。提示HIF-1 a在骨肉瘤组织中的高表达与患者的预后不良密切相关,影响患者的预后。新鲜骨肉瘤组织HIF-1 a、VEGF mRNA总表达率分别为93.3%(14/15)、100%(15/15)。半定量结果显示,肿瘤组织的HIF-1a及VEGF mRNA表达均明显高于瘤旁组织(P<0.05)。2.TSA抑制骨肉瘤MG-63细胞的生长。TSA使细胞体积缩小,折光性增强;悬浮/贴壁比值逐渐增高,细胞活性百分比逐渐降低(P<0.05),并呈明显的剂量和时间依赖性。流式细胞仪检测,随着TSA作用浓度的不断增加,G1期的细胞数目逐渐减少,而S期和G2/M期的细胞数目增加。提示TSA将细胞周期阻抑在G2/M期。Annexin V显示TSA100、200、300、500nM处理细胞24h,细胞的平均凋亡率分别为13.50%±1.73、22.50%±1.45、42.05%±2.47、63.23%±2.77,与对照组比较凋亡明显增加(P<0.05)。TUNEL显示细胞凋亡率随浓度和处理时间的增加而逐渐增加,与对照组比较具有统计学意义(P<0.05)。电镜显示TSA导致骨肉瘤细胞体积变小,细胞质浓缩,产生凋亡小体。TSA抑制骨肉瘤细胞的侵袭,TSA50、100、200、300、500nM处理细胞24h,细胞侵袭性抑制率与对照组比较,具有差异显著性(P<0.05)。3.低氧和低氧模拟物DFX诱导骨肉瘤MG-63细胞HIF-1α及VEGF的mRNA、蛋白表达。在常氧和低氧(1%)条件下,HIF-1αmRNA的表达无明显变化(P>0.05),而蛋白表达却在低氧条件下明显增加;HIF-1α的靶基因VEGF在常氧状态下mRNA和蛋白均有表达,在低氧下表达更明显(P<0.05)。HIF-1α的转录活性在蛋白水平。低氧模拟物DFX与低氧具有同样的诱导HIF-1α表达的作用,VEGF的mRNA和蛋白表达随HIF-1α的转录活性增加而增加。TSA抑制骨肉瘤MG-63细胞低氧模拟诱导的HIF-1α及VEGF表达,并呈量效及时效关系。模拟低氧下TSA300nM处理MG-63细胞24h, HIF-1α的mRNA水平无明显变化,而VEGF的mRNA水平受TSA的抑制而降低;HIF-1α及VEGF的蛋白水平因TSA抑制而明显降低(P<0.05)。模拟低氧24h,给予TSA50、100、200、300、500nM干预,HIF-1α的mRNA水平无明显变化(P>0.05),而VEGF的mRNA表达水平随着TSA浓度的升高均逐渐下降(P<0.05)。HIF-1α和VEGF蛋白表达随着TSA浓度的升高而逐渐降低,与单纯低氧相比,具有明显差异(P<0.05)。模拟低氧条件下,TSA100、300、500nM处理MG-63细胞,4h时HIF-1α蛋白表达无明显变化,8h时出现明显降低;相应地,VEGF的蛋白表达的抑制也在TSA作用8h时出现明显的剂量依赖性,在500nM时与对照组相比降低4倍之多(P<0.05)。结论1.HIF-1α在大多数骨肉瘤组织中过表达。HIF-1α的表达与肿瘤血管生成密切相关。HIF-1α蛋白的出现与患者预后不良相关,尽管其对预后的影响小于外科分期和肿瘤细胞坏死率。2.低氧可以诱导骨肉瘤细胞HIF-1α及其靶基因VEGF的表达,并被组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA所抑制,并呈时间和剂量依赖性。3.TSA在体外可以抑制骨肉瘤细胞的增殖、诱导凋亡、阻滞细胞周期在G2/M期、抑制细胞的侵袭性,并呈时效及量效关系。4.HIF-1α在骨肉瘤的侵袭转移中起重要的作用,HIF-1α的免疫组化检测可作为一种骨肉瘤高度侵袭性的生物标记物。针对HIF-1α靶点的治疗有望成为一种抗骨肉瘤治疗的新策略。TSA可作为一种通过HIF-1α靶点发挥抗癌作用的新型抗骨肉瘤药物。创新性本研究从低氧与血管生成角度探讨HIF-1α在骨肉瘤的侵袭转移中的作用及其与肿瘤血管生成的关系。首次证实HIF-1α在骨肉瘤组织中过表达;HIF-1α的高表达与患者预后不良有关。首次体外研究TSA对骨肉瘤细胞侵袭性的影响,并证实在TSA体外对骨肉瘤细胞的侵袭性有抑制作用。临床和体外实验均证实HIF-1α的表达与血管生成密切相关,低氧可以诱导骨肉瘤细胞HIF-1α及其靶基因VEGF的表达并可为TSA所抑制。意义目前,骨肉瘤的治疗存在早期肺转移、易复发以及化疗药物耐药等疑难问题。肿瘤内部的低氧可以解释以下两个问题:肿瘤转移复发的根源在于远离血管、以无氧代谢生存的缺氧细胞;肿瘤耐药的机制在于这部分缺氧细胞增殖缓慢,不会被化疗药物杀死,且远离血管,抗癌药物达不到有效的浓度。本研究通过临床病例及体外研究,从低氧与血管生成角度探讨HIF-1α在骨肉瘤的侵袭转移中的作用以及与肿瘤血管生成的关系,证实HIF-1α在骨肉瘤组织中之过表达与组织低氧有关,且影响患者预后;低氧可以诱导骨肉瘤细胞HIF-1α及其靶基因VEGF的表达并可为组蛋白去乙酰化酶抑制剂所抑制。从而部分揭示了低氧诱导的HIF-1α在骨肉瘤侵袭转移中的重要作用,为骨肉瘤治疗提供了一个新的靶点和治疗策略。组蛋白去乙酰化酶抑制剂可作为一种通过HIF-1α靶点发挥抗癌作用的新型抗骨肉瘤药物。