微生物源模板合成Au纳米线及其活性的研究

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金纳米粒子(AuNPs)具有宏观材料所不具备的表面与界面效应、体积效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应,而使其在光、热、电、磁等方面具有独特的性质。其中,金纳米线(AuNWs)除具有以上性质外,还有许多特殊的光热性质(表面等离子体共振,SPR)、催化性质和良好的生物相容性,已广泛应用于成像、光热疗法、光伏技术和生物分子传感等领域。因纳米材料性质对其结构具有高度的依赖性,人们一直致力于金纳米线合成方法的开发,以期实现对其结构的精确调控达到改变性质的目的。微生物模板法成本低、条件温和、材料易得、产量高、环境污染小,可获得的纳米材料结构均一,已经被广泛地应用于纳米材料的制备。细菌鞭毛和烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus.TMV)是拥有规则有序拓扑结构的天然纳米管,有较火的长径比,两者表面整齐规则地分布着丰富并且可修饰的活性官能团,是制备金纳米线的理想模板。
  本文应用细菌鞭毛和TMV为模板,分别在其蛋白壳外部和内部合成了金纳米线,并对其活性进行了研究。首先,应用细菌鞭毛为模板,在其外部合成了金纳米线并对其进行了表征,研究了其在多酚抑菌方面的催化作用,并对该金纳米线进行了Ames实验,表明其致突变性的最低浓度远远高于催化浓度。另外,在TMV内部装载金纳米线合成了AT(Au@TMV),在AT外表面连接了叶酸(FA)合成了ATF(Au@TMV@FA)复合物,并对其进行了表征和过氧化物酶性质研究,应用该性质,进一步研究了其在癌细胞检测方面的应用,具体内容如下:
  以细菌鞭毛为模板,在其外部合成了金纳米线。经过对鞭毛提取方法的改进,简化了分离纯化过程,获得了浓度为113.22mg/mL的高纯度的鞭毛。探索出较为温和的实验条件,在保护鞭毛模板基础上合成了金纳米线,其横纵比约为60。经FT-IR和TEM检测,鞭毛表面丰富的官能团作为金纳米线成核位点,控制了金纳米线的成核与生长,合成的金纳米线均匀、致密地分布于鞭毛表面。金纳米线不聚集,也无折叠倾向,呈现出直径均匀的棒状结构。
  研究了多酚类物质毛蕊花苷、橄榄苦苷和橄榄叶提取物(OLE)的最小抑菌浓度(MIC),分别为20、64、64mg/mL。研究了在不同金纳米线浓度下,单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)在1/2MIC浓度毛蕊花苷(10mg/mL)、橄榄苦苷(32mo/mL)和橄榄叶提取物(OLE.32mg/mL)中的生长曲线(OD600);同时研究了单核细胞增生李斯特菌在只有金纳米线(1、2、4、8、16、32、64、128μg/mL)存在时的生长曲线(OD600)。结果表明,金纳米线在1、2、4、8、16、32、64、128μg/mL浓度下,对单核细胞增生李斯特菌无抑菌作用,说明金纳米线能够催化毛蕊花苷、橄榄苦苷、橄榄叶提取物对单核细胞增生李斯特菌的抑菌反应。当金纳米线浓度达到128μg/mL时,可使毛蕊花苷、橄榄苦苷、橄榄叶提取物(OLE)的最小抑菌浓度降低一半,表明金纳米线可以显著提高以上三种多酚物质对单核细胞增生李斯特菌的抑菌作用。
  基于细菌鞭毛模板的金纳米线能够促进多酚类物质的抑菌效果,因此有望在食品包装材料上加以应用。对AMES-MOD ISO kit试剂盒加以改进后进行后续研究实验,首次对金纳米线的致突变作用进行了研究。结果表明,当Au纳米线浓度不高于1024μg/mL时均无致突变作用,作为催化剂时金纳米线的最小催化浓度为128μg/mL,因此金纳米线做催化剂的使用浓度不会导致细菌细胞突变。
  以来源广泛、材料易得的TMV为模板,应用环境友好的实验方法合成了TMV金纳米线AT。透射电子显微镜(TEM)观察显示,纳米线已成功装载在了TMV的中央空腔内,其平均长度约为200nm,横径约为4nm。并对AT进行了X-射线粉末衍射(XRD)表征,结果显示金的结晶程度好。应用TMV蛋白壳外表面具有大量的功能性氨基酸基团,将AT与叶酸(FA)进行了连接,并应用傅里叶变化光谱(FT-IR)分别对FA、AT、ATF进行了分析,结果显示AT与FA通过CO-NH键连接,合成了ATF。
  以TMV为模板合成的ATF具有类过氧化物酶的催化活性,其催化能力和ATF浓度呈线性关系。与辣根过氧化物酶(HRP)类似,ATF催化氧化底物3.3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)受pH、温度和H2O2浓度影响,ATF的最佳催化条件为温度45℃,pH4.0。与HRP不同,较高浓度的H2O2对ATF活性没有抑制作作用,ATF需要1.5mol/L H2O2才能达到其类过氧化物酶活性的最高水。通过对ATF类过氧化物酶活性的催化动力学研究表明,其符合典型的Michaelis-Menten方程,ATF对底物TMB的Km值小于HRP,说明ATF对TMB的亲和能力与催化活性均高于HRP。ATF对底物H2O2的Km值明显大于HRP,这与ATF需要较高的H2O2浓度才能获得最大活性的结果一致,表明在高H2O2浓度下,ATF的活性更稳定。
  通过对苯二甲酸实验和电子自旋共振技术(ESR)分析探讨了ATF催化反应机理,结果表明,其过氧化物酶活性归因于其促进了羟基自由基的产生。HeLa等癌细胞表面特异过量表达叶酸受体,基于ATF表面连接有FA和类过氧化物酶的催化活性,将其应用于癌细胞的检测,可以通过肉眼进行定性检测,也可通过测定652nm处吸光值进行定量检测,其对HeLa细胞最低检测浓度为每毫升2000个细胞,此方法具有良好的特异性。
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