褪黑激素（Melatonin，MLT）是具有多种功能的光信号激素，通过其分泌水平的改变，将光照信息传递给体内相关组织和器官，使其功能活动适应外界环境的变化。体内研究表明，在人的卵巢中存在褪黑激素及其受体；褪黑激素可直接调节且在人、羊、小鼠和猪的卵巢功能，如刺激性激素分泌，促进卵母细胞成熟，诱导胚胎着床等。然而，褪黑激素是否直接参与牛卵泡和胚胎发育的调节，研究报道较少。基于此，本研究进一步探索了褪黑激素及其受体对牛颗粒细胞增殖和凋亡，卵母细胞成熟及体外胚胎发育的影响。利用荧光免疫组化技术首次定位了褪黑激素受体MT1和MT2在牛颗粒细胞中的表达，为研究MLT可能调节牛颗粒细胞发育和功能奠定了基础；另外，还研究了MLT对颗粒细胞中褪黑激素受体MT1和MT2 mRNA表达调节，及MLT对牛颗粒细胞增殖、凋亡和激素分泌等一系列作用。具体内容如下：　　1.褪黑激素受体在牛卵泡颗粒细胞中表达定位　　采用 RT-PCR技术和 Western blot技术分别检测了褪黑激素受体 MT1和 MT2 mRNA、蛋白在牛颗粒细胞中的表达情况，且利用荧光免疫组化技术定位 MT1和MT2蛋白在牛颗粒细胞中的亚细胞分布。结果表明，MT1和MT2 mRNA和蛋白在牛颗粒细胞中均存在表达，且细胞内分布情况相似，褪黑激素受体MT1和MT2蛋白都分布于胞浆和核膜内，但在细胞膜中的信号较弱。MT1主要分布于胞浆和核膜中，且免疫信号主要集中于细胞核周围；MT2亦分布于胞浆和核膜内，但与 MT1相比，免疫信号相对较弱。　　2.外源褪黑激素对颗粒细胞发育和功能的影响　　在该试验中，设置了六个不同剂量的外源MLT处理组（0 pg/mL,400 pg/mL,800 pg/mL,1200 pg/mL,1600 pg/mL,2000pg/mL），采用real-time PCR方法检测了外源MLT是否调节牛颗粒细胞中褪黑激素受体的表达水平；另外检测了外源 MLT对牛颗粒细胞发育及功能的影响，应用流式细胞技术检测了MLT对颗粒细胞周期和凋亡的影响，同时采用放射免疫法测定了培养液中孕酮和雌二醇浓度。结果表明，MLT以剂量和时间依赖的方式调节MT1 mRNA表达，低浓度的MLT（400pg/mL）以时间依赖模式增加MT1表达；而其他浓度的MLT处理后，MT1的表达在48 h时表达量显著高于24 h和72 h时（P<0.05）。添加不同浓度MLT到细胞培养液中培养颗粒细胞不同时间后，MT2 mRNA表达水平的变化不同于MT1 mRNA。MT2 mRNA表达水平并没有显著的剂量依赖性变化。MLT对颗粒细胞周期并无影响。利用细胞周期计算细胞增殖指数=(G2+S)/(G1+S+G2)×100%。结果表明，MLT对颗粒细胞增殖无显著性作用（P>0.05）；MLT以时间依赖性模式对牛颗粒细胞的凋亡有显著的抑制作用，但在剂量依赖模式上并没有显著的差异。不同浓度的MLT添加到细胞培养液中培养颗粒细胞，可促进颗粒细胞中孕酮的分泌，但对雌二醇无显著影响。　　3. RNA干扰褪黑激素受体MT1对牛颗粒细胞发育和功能的影响　　本试验通过RNAi技术对颗粒细胞中MT1基因干扰，使该基因发生转录后沉默，测定在该基因表达转弱的情况下颗粒细胞增殖、凋亡和激素分泌情况，从而推断该基因在颗粒细胞发育中的作用，亦可判断褪黑激素受体在MLT发挥生理功能过程中作用。构建的MT1基因干扰载体（siRNA-1，siRNA-1和siRNA-3）对牛颗粒细胞进行 RNA干扰，结果表明，siRNA-1，siRNA-1和 siRNA-3均对颗粒细胞中 MT1 mRNA具有干扰效果；然而，siRNA-2和siRNA-3的干扰效率略高于siRNA-1，特别是干扰48 h后，干扰效果更为明显；72 h后，MT1 mRNA的表达开始回升，RNA干扰效果开始减弱，这与载体的短暂表达有关。　　利用流式细胞仪检测细胞周期变化，发现不同质粒对细胞周期分布有显著的影响。干扰24 h后，siRNA-1，siRNA-2和siRNA-3组细胞凋亡指数显著高于对照组；48 h后，三组凋亡指数仍高于对照组，特别是siRNA-2和siRNA-3组凋亡指数显著高于24 h时；然而，干扰72 h后，干扰组细胞凋亡指数有所下降。siRNA-2和siRNA-3两个质粒在48 h时干扰效果最明显，siRNA-2组和siRNA-3组中48h凋亡指数显著高于24 h和72 h时的。颗粒细胞转染siRNA-1，siRNA-2，siRNA-3和阴性对照质粒siRNA-C后，收集上清培养液，利用放射免疫方法检测雌二醇和孕酮浓度。结果表明，RNA干扰颗粒细胞中MT1基因后，孕酮和雌二醇的浓度均降低，特别是24 h和48 h时；转染72 h后，干扰效果减小，颗粒细胞分泌激素功能慢慢恢复，孕酮和雌二醇浓度逐渐增加。各干扰质粒间相比，没有显著的差异。