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竹浆造纸中竹木质素的脱除,不但污染环境,而且提高了造纸成本,因此,用基因工程手段培育新型竹材已成为当今国内外的研究热点。目前,在已知竹浆用竹种中,只从绿竹和毛竹中克隆得到木质素合成酶基因CCoAOMT、COMT和CAD,而慈竹中未见报道。为此,本研究以纤维质量好的慈竹为研究材料,采用RACE技术克隆和同源克隆CCoAOMT、COMT和CAD基因,并对其进行生物信息学和组织表达分析,为CCoAOMT、COMT和CAD基因在大型丛生竹遗传改良中的应用提供理论依据。
主要研究结果如下:
1.采用Race技术克隆并获得了一个慈竹木质素合成酶CCoAOMT基因全长序列(GenBank注册号为JF742462),命名为NaCCoAOMT1;COMT基因全长序列(GenBank登录号为JN837484),命名为NaCOMT;CAD基因的保守区及其3RACE cDNA。
2.生物信息学分析结果表明,慈竹CCoAOM7基因cDNA全长序列,全长为1051bp,含有一个777bp的读码框,编码一个包含258个氨基酸的蛋白质,分子量约为28.861kD,等电点为5.33,二级结构中α-螺旋占42.25%,β-转角占8.91%,延伸链占15.89%、无规卷曲占32.95%。氨基酸多序列比对结果表明,慈竹与绿竹的CCoAOMT1基因亲缘关系最近,但慈竹CCoAOMT基因编码的氨基酸与绿竹相比,在第十位点上发生了缺失,5个位点发生了变异。慈竹、绿竹、毛竹、玉米CCoAOMT基因编码的氨基酸中都含有1个相对保守的无序化区域。
慈竹COMT基因cDNA全长序列为1378bp,其编码一个包含360氨基酸的蛋白,分子量约为38.9741kD,理论等电点为5.38。预测其氨基酸序列包含29个酸性残基(Asp+Glu),41个碱性残基(Arg+Lys),总亲水性平均系数0.079。其中176个氨基酸可能形成α-螺旋,32个氨基酸可能形成β-转角,49个氨基酸可能形成延伸链,103个氨基酸可能形成无规卷曲。多序列比对结果发现:慈竹与绿竹COMT基因编码的氨基酸同源率最高,仅11个位点发生了变异。FoldIndex分析结果发现:所选物种中,只有甘蔗COMT基因编码蛋白质含有1个无序化相对保守区域,即CQMED,其余的都不具有无序化特性。
3.NaCCoAOMT1和NaCOMT基因的RT-PCR分析结果表明,NaCCoAOMT1基因的表达主要在较幼嫩的组织。NaCOMT基因在未展开叶、展开叶、笋的中部和茎的中部表达量较高。
4.构建了NaCCoAOMT1基因RNA干扰表达载体。