论文部分内容阅读
背景:心血管疾病(Cardiovascular disease CVD)是全球发病率和死亡率第一的疾病。虽然目前在心血管疾病的诊断和治疗方面已取得了相当大的进步,但仍需要新的干预治疗措施来降低该病的发病率及死亡率。心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)是多种心血管疾病的重要特征,是指在病理因素作用下心肌成纤维细胞过度增殖、心肌胶原沉积增多、各型胶原比例失调(主要是Ⅰ/Ⅲ型胶原比例升高),排列紊乱的过程。MF在心功能失代偿、心肌组织不可逆重构的过程中起重要作用,也是某些恶性心律失常的病理基础。各种类型的心脏疾病都有心肌组织纤维化的病理生理过程参与,如何防治心肌纤维化是目前基础和临床上的研究热点问题,MF发生的机制也在慢慢清楚,可能与血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,ATⅡ)、转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、内皮素(endothelin,ET)、白介素1(interleukin1,IL1)等有关。近些年来,醛固酮(aldosterone,ALD)在MF中的作用受到越来越多的重视。肾上腺皮质分泌的醛固酮(Aldo)是一种盐皮质激素,其主要作用是激活细胞内盐皮质受体(MR),在调节血压和电解质平衡中起着至关重要的作用。临床及临床前大量研究数据表明,醛固酮通过促进心肌组织纤维化,在心脏重构中发挥重要的病理及生理作用,同时醛固酮也通过诱导炎症、氧化应激参与心脏组织的重构。醛固酮导致心肌纤维化的主要信号转导通路如下:1.蛋白激酶C(PKC)信号通路。2.Rho/Rock信号通路。3.钙调神经磷酸酶(CaN)信号通路。4.哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)。5.TGF-β1/Smads信号通路。6.丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路。7.糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)通道。目前通过糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)通道去探讨醛固酮致心肌纤维化的研究相对较少。糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)是一个多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶,普遍存在于真核生物中,最初被确定为胰岛素依赖型糖原合成的关键调节器;在发育和负荷的条件下,GSK-3β参与心脏组织的重构过程;已有研究证实GSK-3β可以调节炎症从而影响心肌组织纤维化,Jope等人首次确认GSK-3β能调节炎症的病理生理过程,他们已经证明GSK3β在刺激促炎细胞因子如白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)和IL-1β的产生过程中是必不可少的。此外,使用GSK-3β特定抑制剂抑制能够显著降低促炎细胞因子的产生,增加抗炎细胞因子的产生。GSK-3β特定抑制剂通过激活自噬进而抑制心肌组织纤维化,相关研究诸如:GSK-3β抑制剂通过激活自噬防止醛固酮诱导的心脏及肾损伤。GSK-3β小分子抑制剂可分为非ATP竞争性和ATP竞争性两大类,其中属后一类的化合物目前已经发现有靛玉红、PauIIon、嘧啶、马来酰胺、吡嚎等等,国内已有相对较多的研究对其进行了研究分析,而前一类化合物目前研究发现的偏少。目前,第1个被报道的非ATP竞争性抑制剂是由Martinez等研究者发现的thiadiazolidinones(TDZD)类化合物。文献数据证明GSK3β抑制剂(TDZD-8)通过调节自噬对6-OHDA帕金森病大鼠左旋多巴所致运动障碍有明显的治疗作用,然而TDZD-8能否通过调节自噬去改善心肌纤维化尚不清楚。故我们想从GSK3β这条通路上做些相关研究,探讨GSK3β抑制剂TDZD-8能否改善醛固酮诱导的心肌纤维化,并探讨改善的具体机制。希望能对预防和控制心肌纤维化、心脏重构提供新的思路,为临床研究和新药研发提供依据。目的:探究GSK3β抑制剂TDZD-8通过调节自噬改善醛固酮诱导的心脏炎症和心肌组织纤维化。方法:8周龄健康雄性Wistar大鼠,室温无菌环境下进行适应饲养1周,所有大鼠均正常进食相同饲料(氯化钠浓度0.4%),正常规律饮食、喂水(体重230~280g)。36只雄性Wistar大鼠随机分为4组,每组9只,分别进行以下处理;1):作为对照组,正常规律饮食、喂水。2):醛固酮盐组,将0.2mg的醛固酮盐溶解于800ul葵花籽油中,每天皮下注射1mg/kg。3):醛固酮盐+TDZD-8组,醛固酮盐联合TDZD-8(GSK-3β抑制剂):将0.2mg的醛固酮盐和0.3mg的TDZD-8溶解于800ul葵花籽油中,皮下注射大鼠,每日1.5mg/kg。4):醛固酮盐+TDZD-8+3-MA(3-甲基腺嘌呤)组,醛固酮盐联合TDZD-8(GSK-3β抑制剂)联合3-MA:将0.2mg的醛固酮盐、0.3mg的TDZD-8和0.2mg的3-MA溶解于800ul葵花籽油中,皮下注射大鼠,每日2mg/kg。所有大鼠均处理观察8周。观察各组大鼠的血流动力学和心脏参数;使用免疫印迹法检测心脏组织中GSK3β,p-GSK3β,VE-cad,α-SMA,LC3,P62等蛋白表达情况。使用实时荧光定量PCR法检测心脏组织中IL-1β,VE-cad,α-SMA,TNF-α,TGF-β,Col I的基因表达情况。使用免疫荧光法检测LC3在心脏组织中的表达情况。使用Masson染色法观察心脏组织纤维化的程度。结果:1.TDZD-8治疗虽然不能改变总GSK3β蛋白质水平,但可以调节p-GSK3β在心脏组织水平的表达,使其磷酸化水平上调,活性下降,表明了TDZD-8具有抑制GSK3β激活的作用;且TDZD-8能抑制由于Aldo-salt导致的IL-1β和TNF-a mRNA高表达的情况。2.醛固酮盐处理导致VE-cadherin mRNA和蛋白表达水平下降,a-SMA mRNA和蛋白表达水平升高,说明醛盐诱导了EndoMT;组织切片中可以看到血管周围纤维化和血管周围胶原沉积;而TDZD-8处理能抑制醛固酮盐诱导的EndoMT。醛固酮盐上调心脏组织中TGF-β和ColI的表达水平,而TDZD-8可以抑制醛固酮盐导致的心脏组织中TGF-β和ColI的上调。3.免疫印迹结果显示,TDZD-8显著上调心肌组织中LC3-II(自噬活化标志物)蛋白水平,表明TDZD-8处理后自噬被激活。TDZD-8处理后p62/SQSTM1蛋白水平降低得到验证,这说明自噬通量增大。免疫荧光结果显示,代表自噬小泡的LC3绿点显著增多,TDZD-8处理后心脏组织中LC3-II积聚,说明TDZD-8激活自噬。4.醛固酮盐处理后血管周围纤维化水平升高,而TDZD-8可逆转这一变化。自噬抑制剂3-MA显著抑制了TDZD-8抑制血管周围纤维化的功能。说明TDZD-8通过激活自噬,在一定程度上保护了醛固酮盐诱导的心肌组织的损伤。结论:1.TDZD-8抑制GSK3β的同时可以缓解醛固酮导致的心肌组织的炎症。2.TDZD-8抑制了醛固酮导致的心肌组织的纤维化。3.TDZD-8激活了心脏组织中细胞的自噬。4.TDZD-8抑制醛固酮导致的心脏纤维化是通过激活自噬介导的。