论文部分内容阅读
目的:探讨Neuritin对大鼠皮层神经元经氧糖剥夺再灌注诱发内质网应激反应介导的相关凋亡通路影响的研究。方法:(1)选取出生24h内SD乳鼠,提取皮层脑组织,经胰酶消化后用含10%胎牛血清的DMEM-HG培养液接种于包被有多聚赖氨酸的六孔板内,2~4h后换用含2%B27的Neurobasal生长培养液培养。(2)每2~3天半量更换生长培养液并在倒置相差显微镜下观察、记录神经元形态变化,NSE/PI双染免疫荧光鉴定神经元纯度。(3)取原代培养7~8天的成熟大鼠皮层神经元,随机分成空白对照组、氧糖剥夺再灌注组、Neuritin治疗组。(4)采用Western Blot技术检测GRP78、Caspase-12与CHOP蛋白的表达,q RT-PCR技术检测GRP78、Caspase-12与CHOP mRNA的表达,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞技术检测神经元调亡率,MTT法计算不同浓度Neuritin下神经元相对存活率并初筛Neuritin最适浓度,透射电子显微镜下观察神经元粗面内质网超微结构变化。结果:(1)成功分离、培养大鼠皮层神经元,显微镜下胞体、树突、轴突形态典型,经NSE/PI免疫荧光法鉴定神经元纯度达90%以上;(2)氧糖剥夺再灌注组GRP78在12h、24h和48h表达较空白对照组明显增加(P<0.05),并在24h达到峰值,有统计学差异(P<0.05);Caspase-12在12h、24h和48h表达较空白对照组明显增加(P<0.05);CHOP在6h、12h、24h和48h表达较空白对照组明显增加(P<0.05);(3)氧糖剥夺再灌注组6h、12h、24h、48h神经元凋亡率较空白对照组显著增加,且有升高趋势,有统计学差异(P<0.05);(4)与空白对照组相比,50ng/mL、100ng/m L浓度Neuritin组神经元活力无明显差异(P>0.05),150ng/m L、200ng/m L和250ng/mLNeuritin组神经元活力有统计学差异(P<0.05),200ng/mL与150ng/mL、250ng/mL浓度Neuritin组相比,神经活力有统计学差异(P<0.05);(5)与氧糖剥夺再灌注组相比,Neuritin治疗组GRP78、Caspase-12与CHOP的表达均明显降低,有统计学差异(P<0.05)。(6)与氧糖剥夺再灌注组相比,Neuritin治疗组能显著降低神经元凋亡率,差异有统计学意义(P<0.05)。(7)氧糖剥夺再灌注组与空白对照组相比,神经元粗面内质网囊腔增大,囊泡化与水肿明显;与氧糖剥夺再灌注组相比,Neuritin治疗组显著恢复神经元粗面内质网体积和形态的连续性,囊泡数量减少,水肿减轻。结论:氧糖剥夺再灌注可导致大鼠皮层神经元ERS反应介导的细胞凋亡;200ng/mL Neuritin能显著抑制氧糖剥夺再灌注后大鼠皮层神经元凋亡,改善细胞活力;Neuritin可以抑制氧糖剥夺再灌注诱发的ERS相关因子GRP78、Caspase-12和CHOP的表达,减轻神经元凋亡率以及缓解神经元粗面内质网的超微结构变化。