第一部分 间充质干细胞驯化的巨噬细胞在脓毒症肺损伤中的作用研究目的：脂肪来源间充质干细胞(Adipose mesenchymal stem cells, ASC)是一种多能分化干细胞,除了再生分化,也参与机体的免疫调节。近年来研究发现ASCs对LPS诱导的肺损伤具有保护作用,而ASCs驯化的巨噬细胞直接输注对肺损伤的作用未见报道。本部分研究主要通过小鼠模型在体观察脂肪来源的间充质干细胞(adipose-mesenchymal stem cells, ASCs)驯化的巨噬细胞在LPS诱导的肺损伤发生发展中的作用。研究方法：采用LPS (Lipopolysaccharide,脂多糖)诱导WT (C57BL/6)小鼠致肺损伤模型,造模后观察小鼠6h、24h、48h体重增长情况；HE染色观察肺脏形态学改变；肺组织称重湿干比检测肺水肿；Luminex检测血液及支气管肺泡灌洗液炎症因子TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-13水平。研究结果：模型后6h和48h ASC组及EM组小鼠体重增长、HE染色中性粒细胞计数及肺湿干比与LPS组相比均无显著差异,而模型后24 h, ASC组与EM组的体重增长较LPS组显著增加(*P<0.05,*P<0.05)；中性粒细胞计数的增加亦明显少于LPS组(*P<0.01, *P<0.05); LPS组的肺湿干比增加最大,48h恢复,而ASC组及EM组的肺湿干比增加不明显、几乎没有肺水肿情况发生(*P<0.05,*P<0.05)。模型后24 h及48 h, ASC组及EM组小鼠外周血与支气管肺泡灌洗液中细胞因子均较LPS组小鼠无差异表现,而在模型6h时,ASC组及EM组小鼠外周血与支气管肺泡灌洗液中细胞因子均较LPS组小鼠有改善,血清中IFN-7 (*P<0.001, *P<0.001)和IL-6 (*P<0.01, *P<0.001)升高水平降低而IL-10 (*P<0.001, *P<0.01)增加,同时减轻肺泡灌洗液中IL-6的水平(*P<0.001,*P<0.001),而IL-4 (*P<0.01, *P<0.001), IL-10 (*P<0.001, *P<0.001)和IL-13 (*P<0.001, *P<0.001)的水平反而增高。研究结论：ASCs驯化的巨噬细胞与ASCs-样,对LPS所致急性肺损伤有保护作用。第二部分 间充质干细胞驯化的巨噬细胞在脓毒症肺损伤中的分子机制的研究研究目的：通过第一部分研究发现,ASCs可以体外驯化巨噬细胞,驯化的巨噬细胞与ASCs-样可以提高肺脏免疫防御能力,减少致炎性炎症因子的瀑布链反应,增加抑炎型炎症因子的表达,减轻肺损伤,对脓毒症肺损伤同样具有保护作用。本部分通过模拟离体脓毒症肺损伤的微环境,探讨ASCs驯化巨噬细胞对肺损伤保护的的分子机制。研究方法：肉汤刺激C57BL/68周野生鼠获取腹腔巨噬细胞与ASC共培养,Luminex检测LPS刺激下不同组间炎症因子变化与流式细胞学检测M2细胞含量,人ARDS血清替代体外LPS作用做LPS的体外模拟比对试验,比较ASC体外在ARDS血清作用下对巨噬细胞表型的作用,给予IL-10刺激巨噬细胞或给予IL-10抗体、IL-10受体的抗体刺激western检测巨噬细胞内Arg蛋白含量及Luminex检测上清液中各炎症因子的变化。研究结果：ASCs与巨噬细胞共培养后M2细胞增加(*P<0.05),而Transwell与直接接触共培养后M2表型无显著差异(P>0.05);ASC直接接触或transwell共培养后增加了IL-10的表达(*P<0.01,*P<0.05)而同时降低了IL-6(*P<0.001,*P<0.001)和TNF-α(*P<0.01,*P<0.05)的表达。体外人ARDS血清加入巨噬细胞的培养基中后,M2表型减少(*P<0.05),而不管直接接触还是transwell共培养,ASC均增加了M2细胞的表达(*P<0.01,*P<0.05)。IL-10加入LPS刺激的巨噬细胞培养基后前炎症因子IL-6和TNF-α明显下降,同时M2给予IL-10抗体后巨噬细胞的Arg蛋白明显减少,IL-6 (*P<0.001,*P<0.001)和TNF-α (*P<0.01,*P<0.001)含量明显回升。相较于ASC与巨噬细胞共培养组,Western结果显示培养基中加入IL-10抗体、IL-10受体的抗体后巨噬细胞内的Arg蛋白表达明显减少,而培养基上清液中炎症因子IL-6 (*P<0.001,*P<0.001)、TNF-α的含量继又增加((*P<0.01,*P<0.05)。研究结论：LPS体外刺激可以模拟体内ARDS血清作用建立sepsis微环境,ASCs驯化巨噬细胞不需要直接细胞接触,驯化的巨噬细胞起作用是通过IL-10途径进行。第三部分 间充质干细胞对脓毒症患儿外周血炎性单核细胞的影响研究目的：结合第一部分和第二部分的研究,动物实验及体外研究均表明ASCs可以驯化巨噬细胞起到抑炎作用。既往研究表明脓毒症发生时炎症瀑布链迅速发生,固有免疫的单核巨噬细胞参与炎症反应,ASC通过自身或分泌可溶性因子对机体的组织器官、细胞进行驯化,调控炎症免疫状态。因此,本部分研究拟采取脓毒症患儿与对照非脓毒症患儿的外周血进行流式单核细胞的分型测定,体外给与ASC共培养观察其在炎症免疫过程中的作用,从而探讨ASC在临床中的应用价值。研究方法：严格按照脓毒症诊断标准,收集2015年6月-2015年10月期间在大学医学院附属儿童医院需要急症手术的外科脓毒症患者18例,并将同期10例非脓毒症外科手术患儿作为对照组。所有纳入患者均在确诊脓毒症后24小时内抽取外周血标本5m1,分离外周血单核细胞,单独体外培养或加ASC共培养12h后用BD流式细胞仪检测炎性单核细胞的比例。所有患者在入院24小时内进行PRIM Ⅲ (Pediaticr Risk of Mortality Ⅲ Score)评分及PELOD Ⅱ (Scoring Pediatric Logistic Organ Dysfunction)评分,并作为反应脓毒症预后指标。分别检测儿童脓毒症患者与其对照组外周血中炎性单核细胞的比例和与ASC共培养后的脓毒症患儿外周血中炎性单核细胞的比例。分析炎性单核细胞与临床预后评分之间的相关性。研究结果：流式细胞检测证实脓毒症患者外周血中炎性单核细胞数量较对照组显著增加(*P<0.05)；这种增多与临床预后PRIM Ⅲ评分与PELOD Ⅱ评分相关(*P<0.05)；而体外给与ASC共培养后脓毒症患者的这种炎性细胞数量立即减少(*P<0.05)。研究结论：儿童脓毒症时外周血炎性单核细胞的增多,这种增多与临床预后相关,同时ASC在体外与单核细胞共培养时能逆转单核细胞的这种炎性改变。