背景:胶质瘤是最广泛和恶性最高的原发性成人颅脑肿瘤,致死率大约为30%。尽管手术切除结合术后放化疗已成为常规治疗方案,预后依然不容乐观。胶质母细胞瘤（GBM,最具侵袭性的胶质瘤）的中位生存时间仅为14个月。尽管已有若干研究揭示了与胶质瘤恶性表型相关的分子机制,并开发了若干潜在治疗靶点,参与促肿瘤生长和侵袭转移等表型的尚未完全阐明。系统性的探索肿瘤相关的分子机制有利于鉴定肿瘤的生物驱动因子并且为胶质瘤的综合治疗奠定理论基础。目前对于肿瘤的个体预后评估及治疗策略主要基于患者基本信息和肿瘤的特异性指标,比如胶质瘤的WHO分级、IDH-1突变、MGMT启动子甲基化状态等等。随着高通量测序技术和公共数据集的蓬勃发展,这两类数据也被广泛应用到了肿瘤诊断和预后的研究之中。然而,目前已有的预测精度和准确度仍然不足,仍有较大改进空间。因此,开发能够精准评估预后的预测工具能够细化区分不同类型的胶质瘤患者群体,有利于在胶质瘤的综合治疗的研究中有目的地针对性选择不同策略。同源盒家族基因（homeobox,以下简称“HOX”）是一组保守性的蛋白编码基因,类型为转录因子,在哺乳动物内共有39个成员。该家族基因在胚胎发育期,对形态建成和脊髓的发育和分化等发挥重要作用。由于该家族的各个成员只在调节特定器官发育或分化期间,在特定的时间点表达,因而被称为“时空性表达”。而DNA甲基化是重要的表达“开关”。目前已发现若干个Hox基因对胶质瘤在内的多种肿瘤的发展和侵袭性发挥作用,但目前仍然缺乏Hox家族基因在胶质瘤的系统性研究。因此,系统性地分析鉴定Hox基因在胶质瘤的表达预后价值有利于今后我们深入了解胶质瘤的分子生物机制并寻找治疗靶点。在此,我们利用胶质瘤公共数据库,分析筛选了表达模式相近并有预后价值的Hox相关基因,并探究了这些基因在胶质瘤内的临床特征及相关功能。另外也对其中关键性分子的直接机制进行了实验验证。旨在对Hox家族在胶质瘤的概况有更全面的认识,以便未来寻找新的治疗靶点。研究方法:2.1材料2.1.1公共数据集我们下载了包含了对应临床信息的TCGA、CGGA的mRNA表达谱数据,TCGA的illumina 450K DNA甲基化芯片数据以及GSE131928单细胞转录组数据。2.1.2病人样本14例胶质瘤组织样本及5例配对的癌旁阴性对照组织样本收集于中国医科大学第一附属医院神经外科。组织样本的病理学及相关分子学特征遵照2016版的胶质瘤分子病理指南来执行,并经两名资深病理学专家进行核验。2.1.3细胞系人胶质瘤细胞系U251、LN229、HS683及U87均购买自ATCC2.2生物信息学方法221 WGCNA 分析我们利用R语言进行加权共表达网络（WGCNA）将表达模式类似的基因聚至统一模块然后对模块内的基因进行筛查。222 ssGSEA 评分单样本GSEA（ssGSEA）评分用于评估特定基因集在的每个样本的总体表达排序,以确定其总体活跃度。基因集下载自MSigDB数据库（http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp）.223 预后模型和分类器构建我们采用高斯混合模型进行聚类,使用反卷积算法中的支持向量机（SVM）来构建分类器,对输入的样本进行分层。224 差异分析和功能富集使用DESeq2软件进行两两组间差异分析,然后用ClusterProfiler软件进行GO、KEGG和GSEA对差异上调和下调的基因进行功能注释。225 免疫微环境评分我们用CIOBERSORT包来计算22种免疫细胞在肿瘤微环境中的富集丰度,用ESTINATE包计算微环境总体免疫细胞和基质细胞评分,以及肿瘤纯度,用以评估免疫微环境状态。226 单细胞转录组分析我们使用Seurat包标准流程进行单细胞转录组分析,包括tSNE降维、聚类分群,差异基因鉴别以及细胞周期鉴定。227 细胞系转录组测序我们将慢病毒构建的U251和LN229的稳转敲低细胞株及空白对照进行转录组测序,数据分析方法参考公共数据库。2.3分子生物实验方法2.3.1慢病毒转导使用慢病毒进行shRNA序列转导,4天后含嘌呤霉素的培养基筛选稳转株,然后以荧光显微镜观察转导效率,并使用RT-qPCR和蛋白印迹（Western-bolt）验证。2.3.2 实时定量PCR（RT-PCR）使用TRIzol法自样本提取总RNA,使用反转录试剂盒以合成cDNA,使用SYBR GREEN试剂盒检测mRNA表达水平,以ACTB作为内参。2.3.3 蛋白免疫印迹（Western-bolt）蛋白提取后使用BCA法进行定量,以562nm吸光度计算浓度,然后使用5X蛋白上样缓冲液及双蒸水将蛋白样品制成3-5ug/ul的WB样品,金属浴100℃ 8分钟变性后4℃冷却以待后用。蛋白免疫印迹:配制SDS-PAGE凝胶,加样,电泳至溴酚蓝至凝胶至底部然后结束,转膜,结束后使用5%脱脂奶粉封闭90min,4℃下孵育一抗过夜。第二日,使用TBST洗膜,室温孵育对应二抗1h,再洗膜,ECL发光成像。2.3.4细胞增殖和周期实验增殖:在验证转导效率后,取对数生长期的实验组shRNA及对照组细胞,接种细胞1000个/孔至96孔板,并培养24h、48h、72h、96h及120h。每孔加入10ul的CCK-8溶液,并在37℃继续培养4h,然后测量450nm吸光度。克隆形成:收集对数生长期的实验组及照组细胞,按500细胞/孔的密度铺于6孔板内并培养2周。然后以甲醇固定细胞并用0.5%结晶紫溶液染色20分钟,拍照计数。周期:收集生长24h细胞,以PBS洗涤2-3次,洗净上清。以1ml预冷的70%乙醇固定细胞并使细胞分离至单个,-20℃过夜。然后1000g X 5min离心收细胞,加入RNAseA150ul重悬细胞,消化30min,后加入DAPI工作液,避光染色15min,然后于流式细胞仪上机检测。2.3.5双荧光素酶报告实验携带HOXB7开放阅读框架（CDS）序列的pcDNA3.1-3xFLAG-HOXB7载体与CCND1启动子结合位点加上下游200bp序列的荧光素酶载体pGL3-Basic及突变体购买自汉恒生物（上海）。将荧光素酶载体质粒和HOXB7载体质粒共同转染模式细胞系HEK-293T,48h后裂解细胞,使用双荧光素酶基因报告系统检测萤火虫荧光素和海肾荧光素的发光值,以海肾萤光素酶为内参。2.3.6染色质共沉淀及PCR实验（ChIP-qPCR）以Flag载体转染U251和LN229细胞,并以WB验证效率。取培养至用量标准的细胞约107左右置于细胞培养皿中,以甲醛交联10min,使得甲醛终浓度为1%。加入甘氨酸到室温终止反应,时间5min。倒去培养基,收集细胞加入720ul ChIP Lysis Buffer冰上裂解20min,冰上超声裂解。12000rpm离心10min取上清,取出50ul作为Input电泳检测。IP组加入10ulFlag抗体,IgG组加入10ul对照血清,混匀4℃振荡器过夜。加入Protein G磁珠4℃振荡器孵育3h,离心,然后分别以低盐、高盐和TE缓冲液洗脱。加入ChIP洗脱液缓冲液洗脱,加入NACL解交联,以RNase和蛋白酶K孵育,DNA纯化试剂盒回收片段,RT-qPCR验证。2.4统计学分析方法所有统计学分析以及绘图均使用R v.4.0.2软件进行。Students’t,Wilcoxon ran sum检验用于评价两组间差异性,Pearson相关性用于检验两组线性数值间相关性。Kaplan-Meier法用于描绘组间生存分布,LogRank检验用于评估组间生存差异。单因素Cox回归用于评估线性指标的生存意义,Schoenfeld’s残差检验用于评估生存指标是否符合PH假定。多因素Cox回归用于计算模型生存价值,方差膨胀因子（VIF）用于评估变量间的多重共线性。P＜0.05被认为是有统计学差异。结果:第一部分:我们筛选出了 11个具有显著预后价值的homeobox相关基因,然后通过聚类可将胶质瘤患者分为HA、HB、HC三组（该分组命名为“Hcluster”）,其风险分别为低、中、高,对应的患者的预后依此变差,所含的侵袭性临床病理表型也越多。然后利用机器学习构建分类器可将验证集队列的患者也进行风险分层。此外,我们进一步构建的Hcluster结合患者年龄及WHO分级的列线图可对患者1-5年生存率进行准确预测。接下来我们发现,HA、HB、HC三组逐渐活跃的功能主要和淋巴细胞迁移、细胞周期、转移有关。而且免疫微环境的免疫细胞与间质细胞评分在HA、HB、HC逐级升高,而M2巨噬细胞的富集丰度也呈同样的趋势,肿瘤纯度则正相反。最后我们筛选到了 11个预后因子中的枢纽基因HOXB7进行后续的功能研究。第二部分:HOXB7在胶质瘤表达高于正常脑组织,级别与恶性程度越高则表达越高,同时预后也更差。HOXB7与间质亚型评分呈正相关,前神经亚型则相反。高表达的HOXB7与增殖和细胞周期有关。敲低HOXB7可使胶质瘤细胞增殖减慢,同时阻滞与G0/G1期的细胞比例增加。而且,HOXB7可以靶向结合细胞周期蛋白的CyclinD1的上游启动子并调控该基因的转录,从而调节胶质瘤细胞的增殖。结论第一部分:我们筛查了并确定了 Hox家族基因中在胶质瘤的显著预后因子,并通过构建预后模型和分类器精细化评估胶质瘤患者的生存风险。第二部分:HOXB7是胶质瘤的促瘤基因,表达与高侵袭性和低生存时间呈正相关。此外HOXB7可通过靶向调节CyclinD1转录,调控细胞周期,从而促进胶质瘤的增殖。