背景：神经细胞脱髓鞘病变(demyelination)是一个世界性公共卫生问题,调查显示,就其主要累及疾病多发性硬化(mutiple sclerosis)目前全球约有300-400万患者,占神经系统发病率的6%-10%,而临床上除多发性硬化、进行性多灶性白质脑病等慢性脱髓鞘病变外,创伤后急性髓鞘损伤,一氧化碳等中毒导致脱髓鞘也较为常见。急性发作或亚急性损害神经中枢的疾病,发病高峰为二到三周,若治疗延误受损神经继发缺血变性则发生多发性硬化,发病严重时可侵犯脊髓前角细胞和脑干神经核以及大脑运动皮质锥体细胞危及生命,多为基因免疫异常或病毒感染所致。早期的治疗多以激素及营养疗法治疗,但疗效难以控固,由于本病导致髓鞘脱失致神经功能损害严重时继发轴索损害从而复发使神经功能症状进一步加重·病情继发加重。脱髓鞘疾病是一类病因不相同、临床表现各异、但有类同特征的获得性疾患,其特征的病理变化是神经纤维的髓鞘脱失而神经细胞相对保持完整。髓鞘的作用是保护神经元并使神经冲动在神经元上得到很快的传递,所以,髓鞘的脱失会使神经冲动的传送受到影响。急性脱髓鞘性疾病的神经髓鞘一般可以再生,虽然再生的髓鞘较薄,但一般对功能恢复的影响不大。慢性脱髓鞘性神经病,由于反复脱髓鞘与髓鞘的再生许旺细胞明显增殖,神经可变粗,并有轴突丧失,因此功能恢复不完全。目前,导致慢性非感染性神经细胞轴突脱髓鞘损伤的免疫机制尚未完全阐明,因而对此类疾病并未形成常规,有效的质量方案。传统治疗方式以对症治疗为主,缺乏针对性,以多发性硬化为例,病程可在10年以上,即使接受合理治疗,预后也往往较差,致残率高。人体神经系统中髓鞘由少突胶质细胞和施旺细胞形成,中枢神经系统髓鞘以少突胶质细胞占主要部分,周围神经中髓鞘则全由施旺细胞构成。正常生理状况下,因外伤或毒素等因素造成局部轴突脱髓鞘损伤后,损伤局部聚集大量巨噬细胞清除细胞残留组织,随后少突胶质细胞前体动员并逐渐分化成熟成为少突胶质细胞并形成髓鞘包裹裸露的神经元轴突。现已明确,神经脱髓鞘疾病是由于髓鞘形成细胞增值能力减弱或分化成熟障碍导致。以多发性硬化为例,其具体致病机制主要是由于自身免疫系统介导的非感染性炎症反应所致。综上所述,寻找到有效途径刺激少突胶质细胞增生分化成为治疗关键。随着对干细胞研究的逐渐深入,现代科学技术对干细胞定向分化控制有了长足的进步,特别是获得2013年诺贝尔生理及医学奖殊荣的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells)的发现,使得现代医疗对干细胞安全性大大提高,相较于传统纯体外诱导胚胎或骨髓干细胞,诱导多能干细胞利用体内已分化成熟但还具有干细胞潜能的细胞,施以不同刺激因子控制其向目标细胞分化,其定向分化能力较容易控制,分化目标较为明确,目前,越来越多的科研论文围绕多发性硬化等神经脱髓鞘疾病展开研究并取得相关进展。前期实验中发现,位于脊髓中央管处的室管膜细胞可被干细胞转录因子sox2抗体标记,由此可认为室管膜细胞具有一定干细胞特性,本研究最初假设室管膜细胞在脊髓脱髓鞘损伤后可被诱导激活干细胞特性参与髓鞘再生过程,利用fate-mapping(基因免疫荧光示踪技术)定向标记室管膜细胞特异表达的foxj1基因片段,以追踪其是否可向髓鞘损伤区域移动分化最终形成髓鞘再生相关细胞,但此假设并未于实验中得到认证。但在实验中,发现在脊髓周边神经根等周围神经组织内出现foxj1阳性细胞,并在脱髓鞘损伤后14天定向移动到损伤区域,后续荧光免疫组织化学染色证实其可进一步分化成为施旺细胞。目的：通过fate-mapping(基因免疫荧光示踪技术)对脊髓白质急性脱髓鞘损伤后foxj1标记细胞迁移和分化的动态观察,结合免疫荧光染色、蛋白质印记分析,DNA测序等方法鉴定周围神经中foxj1的细胞类型,分析其来源、如何参与脊髓急性脱髓鞘损伤后髓鞘再生过程探索其与施旺细胞分化的相关性,并通过体外培养成纤维细胞实验进一步论证上述理论,首次提出周围神经中类成纤维细胞逆向进入脱髓鞘损伤后中枢神经系统并参与完成髓鞘再生过程,旨于提出施旺细胞的新来源。方法：1.研究对象主要包括动物实验和细胞实验：动物实验主要以转基因小鼠为研究对象,共纳入三种不同的Cre-lox系统转基因小鼠。Cre/Loxp重组系统策略是进行基因组定点突变的新途径,该系统在80年代被引入后,已被成功的应用于酵母菌、植物、哺乳动物细胞培养及小鼠身上。Cre/Loxp重组系统可在哺乳类细胞和转基因鼠中因Loxp位点设计的不同而产生特异性重组其应用主要包括基因失活或敲除、基因激活、基因颠换、基因易位,还可以利用此系统进行载体的构建Cre/Loxp重组系统包括Cre重组酶和Loxp位点两个部分,本实验转基因动物均由美国JAXMICE转基因动物公司创建,于不同目标基因转入可调控绿色荧光蛋白编码基因,并在标记蛋白编码启动子基因上游插入终止子序列,于终止子序列上下游同时标记loxp位点,此位点可被Cre识别并定向切除,切除后转入标记蛋白即可表达进一步标记目标基因,本实验中两种小鼠CRE表达需要雌激素三苯氧胺(tamoxifen)注射或灌胃诱导,因此可选择特定时间点观察目标细胞的的动员分化情况,本实验所纳入的两种可诱导转基因表达的小鼠分别是：●FOXJ1-CreERT2;Rosa26R-GFPForkhead box protein J1简称为foxj1,通常被认为是一种与纤毛发生相关的编码基因,通过对斑马鱼和小鼠研究发现,此基因可编码运动纤毛,故在肺脏,肾脏等滤过功能的脏器的大量细胞中存在。在脊髓中,之前被认为可作为可靠标记物定向标记脊髓中央管的室管膜细胞。前期实验发现位于脊髓中央管内室管膜细胞可被Sox2抗体标记,而Sox2对胚胎干细胞细胞基因转录具有关键性的调控作用,可认为它们是保持胚胎干细胞细胞多潜能性和自我更新的中心物质。因此室管膜细胞大量表达Sox2提示其具有一定干细胞潜能,为了追踪室管膜细胞在脊髓脱髓鞘损伤后是否参与髓鞘再生过程,我们对目标小鼠foxj1基因段敲入绿色荧光蛋白,也就是说转基因小鼠FOXJ1CreER2T;Rosa26R-eGFP/+,经诱导后,体内所有表达foxj1的细胞及其分化后细胞可被绿色荧光蛋白标记,大量文献支持,在脊髓中其可被作为室管膜细胞的特异标记物。●Fgfr3-icreERT2:Rosa26-YFP成纤维细胞生长因子受体3(fibroblast growth factor receptor3,FGFR3)。 FGFR3是一类具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受体。它和配体结合后通过一系列信号转导途径,完成复杂的细胞内外信号转导,从而完成神经发生、分化、树突分支及神经元存活等功能。FGFR3在发育中的中枢神经系统中广泛表达,一些研究表明,它和少突胶质细胞的发生密切相关,一般认为它和中枢神经系统发育有关。此转基因小鼠在注射三苯氧胺后,体内FGFR3表达的细胞及其所有细胞系可自发黄色荧光,在中枢神经系统脊髓中,如转基因动物模型成功,星形胶质细胞和室管膜细胞均可被标记黄色荧光。本实验还引入一种不受调控表达的转基因动物：●Wnt1-Cre:Rosa26-YFPwnt1是原癌基因家族中一员,有促进细胞增殖的作用。抑癌基因抑制细胞增殖,原癌基因促进细胞增殖。通过合成特殊的RNA和蛋白质,再进入细胞核促进细胞DNA复制,来促进细胞分裂增殖。在胚胎发育阶段,wnt1在神经嵴中广泛表达。由于此动物不受调控表达,这意味着在胚胎期所有表达wnt1的细胞都可以被标记,因此在出生后所有来源于神经嵴的细胞都可以被荧光蛋白所标记。实验动物来源于美国Jaxmice实验动物公司(JAX(?)Mice)。剑桥大学兽医学院实验动物中心(innes building, vet school,university of Cambridge)进行后续繁殖培育及动物基因型检测。动物实验者已获得英国内政部(UK Home Ofiice)颁发动物实验执照。2.脊髓脱髓鞘模型构建本实验使用溶血卵磷脂(lysolecithin)脊髓白质显微注射诱导脱髓鞘损伤模型。选取脊髓、白质局部注射溶血卵磷脂,毒素诱导脊髓神经轴突急性脱髓鞘损伤。选择脱髓鞘损伤后5天,14天,21天用4%多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)灌注,脊髓采集做冰冻切片。3.周围神经中foxj1细胞体内鉴定利用免疫荧光染色技术检测脊髓及坐骨神经中foxj1细胞在正常、损伤后5天、14天和21天的分布情况,横向研究比较不同损伤后时间点,foxj1迁移、分化的差异,以及用不同细胞特征性抗体标记物鉴定foxj1细胞类型,用以确定其是否具有干细胞潜能及分化方向。同时利用蛋白质印记技术(western-blot)及RNA测序比对,从转录及翻译水平检测此foxj1细胞是否真实表达foxj1或只是假阳性染色造成。4.周围神经中foxj1细胞体外鉴定取新鲜成年转基因小鼠坐骨神经,分离纯化周围神经中成纤维细胞,选择培养后21天左右时间点固定细胞,免疫组织化学荧光染色后分析其细胞类型。5.周围神经中foxj1细胞功能研究两种转基因动物均做脊髓腹索、背索做溶血卵磷脂毒素急性诱导脱髓鞘损伤,并取单侧坐骨神经做压迫损伤,与损伤后5天、14天、21天灌注取材后,1、做O.C.T.(聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)包埋后冰冻切片；2、DAB(二氨基联苯胺)染色后做树脂包埋切片。通过荧光光学显微镜及投射电子显微镜分析其1、周围神经损伤前细胞类型,2、在周围神经损伤后是否分化为施旺细胞参与髓鞘再生过程,3、中枢中出现的部分施旺细胞是否来源于周围神经中成纤维细胞。结果1.室管膜细胞在脊髓脱髓鞘急性损伤后变化情况Foxj1基因在正常脊髓及周围神经表达情况FOXJ1CreER2T;Rosa26R-GFP转基因小鼠注射三苯氧胺(tamoxifen)后,间隔5-7天取灌注后脊髓做冰冻切片后做免疫荧光染色后发现,在脊髓中央导髓管围绕一圈室管膜细胞,此与之前文献报道吻合,证明本转基因小鼠可以对室管膜细胞做良好的免疫示踪；但在脊髓周围神经根处亦发现有大量免疫荧光标记物,经反复实验,多组动物比较确认其并不是非特异染色,且尚无文献提及在周围神经中存在foxj1表达细胞。后续取离脊髓位置较远的坐骨神经切片染色,此荧光染色细胞表达稳定。Foxj1细胞在脊髓背索急性脱髓鞘损伤后变化FOXJ1CreER2T; Rosa26R-GFP转基因小鼠注射三苯氧胺后5天,于脊髓背索注射溶血卵磷脂(lysolecithin),急性脱髓鞘损伤造模成功后,分别于术后5天、14天多聚甲醛灌注取小鼠脊髓做冰冻切片免疫荧光染色发现：损伤后5天无明显绿色荧光染色细胞向损伤区域迁移,通过免疫荧光双标染色技术,选少突胶质细胞特异性抗体少突胶质细胞转录因子-2(olig2)或星形胶质细胞标记物抗体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和绿色荧光蛋白双标发现：foxj1标记细胞并无向上述两种细胞分化迹象。损伤后14天重复上述实验,结果相似。Foxj1细胞在脊髓背、腹索急性联合脱髓鞘损伤后变化FOXJ1CreER2T; Rosa26R-GFP转基因小鼠注射三苯氧胺后5天,于脊髓背、腹索联合注射溶血卵磷脂(lysolecithin),急性脱髓鞘损伤造模成功后,分别于术后5天、14天多聚甲醛灌注取小鼠脊髓做冰冻切片免疫荧光染色发现：术后7天前后角均无绿色荧光细胞向损伤区域迁移现象,免疫荧光双标染色结果与单纯前角损伤结果相似；术后14天脊髓背索依然无明显变化,但在术后14天脊髓腹索损伤处发现大量绿色荧光细胞聚集在后角背侧,选施旺细胞标记物抗体轴突周围蛋白(periaxin)染色发现,部分foxj1细胞同时被两种抗体双标。2. Foxj1细胞种类及功能鉴定周围神经中foxj1基因表达鉴定因明确脊髓中室管膜细胞一定含有foxj1基因并有表达,因此设置脊髓作为阳性对照组。通过PCR及western-blot的方法从转录及翻译水平验证了周围神经中foxj1确实有持续稳定表达,并不是染色或转基因出现的假阳性现象。未受损周围神经中GFP+细胞组织染色鉴定为了鉴定周围神经中不同细胞类型,我们选取了特异性抗体对其逐一标记与GFP双重染色后可以鉴定其具体细胞类别。周围神经中髓鞘化的施旺细胞选取periaxin抗体标记,不形成髓鞘的施旺细胞选取S100蛋白抗体标记,周细胞选取PDGFRβ抗体标记,血管内皮细胞选用CD31抗体标记,对成纤维细胞,我们选用了P4HB、Fibronecting、SMA以及HSP47等抗体进行标记,同时也引入了SOX10、Laminin、PO等抗体对上述标记细胞辅助证明。结果发现未损伤周围神经中,GFP标记的绿色荧光蛋白与成纤维细胞特性标记物P4HB、HSP47、SMA、Fn等都出现大部分细胞双重标记的情况,而少量GFP+细胞呈宽条状,细胞点状染色可以与CD31血管内皮细胞出现双标的情况。PDGFRβ除在神经外膜上出现双标的情况外,在神经束中观察不到有双重标记的细胞。其他施旺细胞抗体都未能观察到标记GFP细胞。周围神经夹闭损伤后GFP+细胞变化周围神经在夹闭损伤14天后,较正常周围神经,GFP标记细胞明显增多,绿色荧光蛋白染色密度大幅增高,损伤区域染色细胞形态变化不明显。与成熟髓鞘化施旺细胞抗体periaxin染色后发现,原不能被标记的GFP染色细胞在损伤后表达periaxin,可以被periaxin抗体标记为红色。提示原GFP标记的成纤维细胞在损伤后发生细胞分化。脊髓白质腹索脱髓鞘损伤后GFP标记细胞迁移及变化脊髓白质背索脱髓鞘损伤后,位于损伤部位边缘处聚集大量绿色荧光蛋白染色细胞,经过免疫组织化学双重标记染色后发现,这种GFP标记细胞不能表达少突胶质细胞相关的Olig2蛋白,也不能表达与星形胶质细胞相关的GAFP蛋白同时也与少突胶质细胞形成髓鞘的IBA1蛋白无明显关联。共聚焦荧光显微镜观察照片发现,在脱髓鞘损伤区域所见大量绿色荧光蛋白染色细胞中可见与成熟髓鞘化施旺细胞的标记物periaxin大量双重标记,证明这种绿色荧光标记细胞从周围神经进入脊髓脱髓鞘损伤区域后具有表达periaxin的能力。而FGFR3转基因动物脊髓脱髓鞘损伤术后14天免疫组织化学染色GFP与periaxin后发现,脊髓中脱髓鞘损伤区域施旺细胞没有与免疫荧光示踪细胞双重标记,提示FGFR3所示踪的少突胶质细胞和室管膜细胞不能参与脊髓脱髓鞘损伤后的髓鞘再生过程。体外成纤维细胞培养染色鉴定取成年foxj1转基因小鼠双侧坐骨神经按照上述实验步骤分离消化培养14天后换纯化培养液,继续培养7天后固定。用上述标记不同细胞种类抗体逐一与GFP抗体双重标记,结果如下图示：大部分GFP标记细胞在体外细胞培养条件下可以表达SMA、HSP47、P4HB以及Fn等成纤维细胞标记物。同时还有部分表达Sox10.3.周围神经参与髓鞘再生成纤维细胞的来源探寻新生转基因小鼠未受损周围神经与Sox10染色情况新生小鼠出生后第一天开始胃饲三苯氧胺,连续四天。于小鼠30天时灌注采集标本。利用免疫组织化学的方法,GFP与Sox10双重标记染色,并未发现在未受损周围神经中存在可以被GFP和Sox10双重标记的细胞。新生转基因小鼠未受损周围神经与periaxin染色情况新生小鼠出生后第一天开始胃饲三苯氧胺,连续四天。于小鼠30天时灌注采集标本。利用免疫组织化学的方法,GFP与periaxin双重标记染色,未发现在未受损周围神经中存在可以被GFP和periaxin双重标记的细胞。wrnt-1小鼠脊髓脱髓鞘损伤后变化情况成年wnt-1小鼠与periaxin染色后发现,在脊髓周围神经根中存在大量wnt1标记源于神经嵴的细胞,但在小鼠脊髓白质腹索脱髓鞘损伤区域,虽然可见大量periaxin染色细胞,但没有wnt-1标记绿色荧光蛋白染色细胞。上述现象提示,在小鼠脊髓腹索脱髓鞘损伤后,参与髓鞘再生的周围神经来源的细胞并不是源于胚胎阶段神经嵴细胞。结论1.在一期实验中证实由foxj1标记的室管膜细胞不能参与脊髓白质脱髓鞘损伤,就实验观察时间内,未发现任何证据室管膜细胞可以迁移至损伤区域并分化成为其他参与髓鞘再生的细胞；同时发现了在周围神经中存在可以表达foxj1的细胞并假设其可以参与完成中枢神经系统的髓鞘再生。2.通过两种转基因动物的引入,排除了脊髓中损伤区域绿色荧光蛋白标记细胞来源于脊髓的可能,同时通过免疫组织化学染色的方法鉴定出参与脊髓脱髓鞘损伤髓鞘再生的细胞来源于周围神经中的成纤维细胞并论证其具有一定干细胞特性可以进一步分化成为施旺细胞直接参与脊髓中髓鞘再生过程。这一发现增加了施旺细胞的又一来源,同时发现了体内成熟细胞具有干细胞特性并能在一定条件下发挥其潜能的现象3.通过引入神经嵴标记动物wnt-1,以及发育学实验对能分化成为施旺细胞的周围神经中成纤维细胞的来源做了探索性讨论。Wnt-1与其他抗体染色结果提示这种成纤维细胞有可能不直接来源于胚胎阶段神经嵴细胞。发育学实验进一步证实其不可能从未成熟的施旺细胞中分化而来。