无花瓣油菜Apet33-10花器官形态发生及差异表达基因分析

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Apet33-10(Brassica napus)是一个单基因控制的无花瓣甘蓝型油菜突变体。形态学观察结果显示,在花器官原基形态发生、分化阶段,无花瓣油菜和有花瓣油菜之间没有形态学的差异;而当花器官原基进入生长、增殖及特化阶段,无花瓣油菜的花器官始终没有观察到花瓣的生长和分化。无花瓣油菜Apet33-10的花瓣发育障碍发生在花器官形态发生和分化的早期阶段。以Apet33-10和有花瓣油菜Pet33-10早期花蕾为材料,通过抑制消减杂交和RT-PCR方法,分离和鉴定了18个差异表达基因。这些基因的功能涉及多个方面,如花瓣的特征决定、钙离子信号转导、前体mRNA的剪接和加工、蛋白质的合成与降解、细胞骨架的构建、H~+的转运、核酸的结合、生物碱的合成等。除了APETALA3基因特异性参与花瓣发育调控外,其余的基因都是植物细胞生长、发育所必需的。Apet33-10的无花瓣突变可能导致了主要的转录因子(如AP3)的表达变化,从而引起级联效应,使得一系列植物生长、发育的相关基因在转录水平上的发生改变,最终导致花瓣的缺失。通过RT-PCR克隆得到了在Apet33-10中下调表达的三个AP3基因(BnAP3-2、BnAP3-3和BnAP3-4)。进化树分析显示这三个AP3基因分属3个不同的进化簇,BnAP3-2与甘蓝(B.oleracea)的Boi2AP3在同一簇:BnAP3-3与甘蓝的BoilAP3在同一簇,而BnAP3-4与白菜型油菜(B.rapa)的BrAP3在同一簇。Real-time定量PCR分析结果显示,在野生型甘蓝型油菜早期花蕾中的表达比例为3.67:3.68:1:在无花瓣油菜中3个基因表达量均被下调,依次为野生型的36.6%、28.3%和66.8%,AP3的整体表达量相当于野生型油菜的45%,3个基因的表达比例为2.19:1.74:1。在无花瓣油菜雄蕊中,AP3基因的表达量正常。酵母双杂交结果显示三个AP3与BnPI-3具有不同强度的相互作用能力,序列差异、不同的表达模式以及与PI结合强弱的差异,显示出甘蓝型油菜中3个AP3存在一定的功能分化。小核糖核蛋白D1(BnSmD1)在Apet33-10幼嫩花蕾中表达量显著降低。为了研究其功能,构建了BnSmD1正义植物表达载体pFGC-BnSmD1(+)和反义植物表达载体pFGC-BnSmD1(-)。以甘蓝型油菜197子叶柄为外植体,经5.0mg/L的Basta选择,总共获得52株再生苗,其中包括正义BnSmD1表达载体转化的再生苗43株和反义BnSmD1表达载体转化的再生苗9株。部分BnSmD1正义表达的转基因植株得到PCR验证,为进一步研究油菜小核糖核蛋白的功能奠定了基础。
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