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研究背景肺癌是当今世界发病率和病死率增长最快,对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤。转移是肺癌的恶性标志和特征,也是导致治疗失败和患者死亡的首要原因,约有30%的肺癌患者在首诊时已有远处转移,另有50%-60%在治疗过程中发生远处转移,80%-90%的肺癌死亡是由转移引起。而近年来时间生物学(Chronobiology)在肺癌研究领域的运用为我们揭示肺癌转移的分子机制这一难题开辟新思路。生物钟基因不仅参与调控正常细胞的各种生物学行为,同样也影响着肿瘤细胞的多种生物学行为,可能是一种肿瘤抑制基因。近年来生物钟基因特别是Period基因已成为国内外肺癌研究领域内的一个新焦点[3-5]。研究提示Period基因参与了肺癌的发生、发展及细胞凋亡等多种生物学行为。目前已知可能抑制肺癌转移的基因有CDH1,Nm23,KAI1和MTS1等。可能起促进肺癌转移作用的基因有c-Myc,VEGF和CD44。但对于Period基因是否参与了对肺癌侵袭转移能力的调控,国内外目前还没有相关研究。目的探寻Per2基因在人肺癌中侵袭转移方面的作用和意义。方法体外实验构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-Per2,慢病毒包装,并采用慢病毒转染人A549肺癌细胞,构建稳定转染的A549细胞株,RT-PCR和Western Blotting法鉴定过表达Per2基因表达。改良Boyden小室法和划痕实验法检测稳定转染细胞体外侵袭迁移能力的变化。RT-PCR和Western Blotting法检测NM23、VEGF、C-MYC、CDH1和CD44基因和蛋白的表达水平。体内实验：运用免疫组化技术检测皮下移植瘤中Per2,Nm23和CDH1的表达水平。通过裸鼠尾静脉注射稳定转染A549细胞,构建裸鼠A549肺癌细胞侵袭迁移模型,解剖两组裸鼠的脑、肺、肝和肾上腺组织,进行HE染色,进行统计分析。结果体外实验：RT-PCR实验结果证实OE(over-expressed)组比NC(negative control)组Per2基因表达量高出11倍。Western blotting结果也显示OE组较NC组Per2基因表达量明显提高,并通过灰度定量分析,两组之间差异有统计学意义(P=0.0425)。体外侵袭和迁移实验结果表明NC组细胞穿透小室的平均细胞数为134.2±7.165和130.8±9.987。OE组细胞穿透小室的平均细胞数为56.80±6.763和20.20±4.164,NC组明显高于OE组(P<0.0001和P<0.0001)。 划痕实验NC基因组细胞平均迁移距离为452.8±5.279像素,OE细胞平均迁移距离315.4±5.743像素,两组之间差异有统计学意义(P<0.0001)。RT-PCR和Western blotting结果也表明OE组细胞的VEGF、CD44和c-Myc基因的表达和蛋白水平明显低于NC组,CDH1和Nm23的表达水平明显增高(P值均小于0.05)。体内实验：皮下移植瘤免疫组化发现：OE组中Nm23和CDH1的表达水平高于NC组,差异有统计学意义(P=0.0383和0.0232)。结论Per2基因明显降低了A549肿瘤细胞的侵袭迁移能力。Per2基因通过调节与肿瘤侵袭迁移相关基因来抑制A549肿瘤细胞侵袭迁移能力。其中,Per2基因下调A549细胞中的促肿瘤侵袭迁移相关基因,如VEGF、CD44和c-Myc基因的表达水平,上调抑肿瘤侵袭迁移相关基因,如Nm23和CDH1。本实验为深入研究Per2基因影响肺癌侵袭转移的分子机制和信号通路奠定基础,具有重要的理论意义,并可为肺癌侵袭转移的诊断与治疗开辟新的思路。