目的:建立GLUT1双荧光质粒示踪体系,观察GLUT1在软骨肉瘤细胞中的亚细胞定位,阐明穿心莲内酯(Andrographolide,Andro)在调控软骨肉瘤细胞能量代谢重编程中的作用机制。方法:1.通过构建双荧光示踪质粒mCherry-EGFP-GLUT1观察软骨肉瘤细胞中GLUT1的亚细胞定位情况。2.运用公式建立双荧光GLUT1转运系数计算模型。3.构建 GLUT1 突变体 mCherry-EGFP-GLUT1-S226D、mCherry-EGFP-GLUT1-△C4确定mCherry-EGFP-GLUT1双荧光质粒检测GLUT1在细胞内转运的特异性。4.利用双荧光示踪工具、免疫荧光法检测葡萄糖剥夺对软骨肉瘤细胞GLUT1转运的内吞转运过程的影响。5.采用葡萄糖摄取实验(2-NBDG)、糖酵解压力试验检测细胞外酸化率(ECAR)、流式细胞术等相关技术检测穿心莲内酯对软骨肉瘤细胞葡萄糖代谢的影响。6.利用双荧光示踪工具、质膜分离法、蛋白质免疫印迹法(Western Blotting,WB)检测穿心莲内酯对软骨肉瘤细胞GLUT1蛋白亚细胞定位的影响。结果:1.mCherry-EGFP-GLUT1双荧光示踪质粒可以用于观察GLUT1从中性内吞体到酸性溶酶体之间的转运。2.TC值可较好的反应软骨肉瘤细胞中GLUT1在质膜与酸性溶酶体间的亚细胞转运情况。3.突变体mCherry-EGFP-GLUT1-S226D阻碍了无糖诱导的软骨肉瘤细胞中GLUT1-S226D的溶酶体积聚,突变体mCherry-EGFP-GLUT1-ΔC4在正常葡萄糖浓度的条件下无法回收到质膜,而被扣留在了溶酶体系统中,由此验证了mCherry-EGFP-GLUT1双荧光质粒检测GLUT1在细胞内转运的特异性。4.葡萄糖剥夺可诱导软骨肉瘤细胞中的GLUT1转运,并与溶酶体标记物LAMP1、晚期内吞体标记物Rab7的共定位程度较高。5.穿心莲内酯可降低糖酵解限速酶HK2、自噬信号因子p-p70S6K、SOX9蛋白水平的表达,上调了 Nrf-2提示了穿心莲内酯通过调节自噬和葡萄糖代谢来抑制软骨肉瘤的生长。6.穿心莲内酯减少了软骨肉瘤细胞的葡萄糖摄取和糖酵解代谢。7.穿心莲内酯下调了 GLUT1在软骨肉瘤细胞质膜上的表达,并导致GLUT1转运至细胞内溶酶体聚集。结论:1.双荧光的GLUT1示踪工具可用于实时监测内吞过程中GLUT1的转运。2.穿心莲内酯可通过减少葡萄糖摄取及糖酵解来抑制软骨肉瘤细胞的生长。3.穿心莲内酯通过靶向GLUT1进入溶酶体降解来抑制GLUT1的表达。4.pmCherry-EGFP-GLUT1可以作为生物传感器用于依赖于GLUT1的功能研究和潜在的小分子筛选。