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第一部分Connexin30基因敲除和条件诱导性Connexin26基因敲除小鼠模型的建立和鉴定目的：建立及鉴定Connexin30（Cx30）基因敲除和条件诱导性Connexin26（Cx26）基因敲除小鼠模型。方法：通过遗传学手段，使用具有C57BL背景的Cx30基因敲除小鼠与具有CBA／Caj背景小鼠杂交八代获得具有CBA／CaJ背景Cx30基因敲除小鼠；使用Cx26loxP／loxP小鼠与R26Cre-ERT小鼠杂交，获得Cx26条件敲除小鼠(Cx26loxP／loxP；Rosa26CreER)，在小鼠的孕19天对孕鼠给予单次他莫西芬（tamoxifen，TMX）腹腔注射，剂量为每10克体重1mg。使用报告基因小鼠Rosa26CreER／LacZ-stopLacZ染色来检测TMX诱导的Cre重组酶活性及分布。基因分型（genotyping），蛋白印迹杂交法（western blot）和免疫组化用来确定Cx26和Cx30在这两种基因敲除动物模型中敲除情况。听力阈值改变使用听性脑干反应（auditory brainstem responses，ABR）来检测。结果：Rosa26CreER／LacZ-stop报告基因小鼠LacZ染色结果显示注射TMX后耳蜗感觉上皮和外侧壁中存在强Cre重组酶活性。基因分型，westernblot和免疫组化结果确定在这两种基因敲除动物模型中Cxs被敲除。ABR结果显示，这两种Cx基因敲除的小鼠在所有检测频率中均表现为重度到全聋的听力损失。结论：我们成功的建立并鉴定了Cx30基因敲除和条件诱导性Cx26基因敲除遗传性非综合征耳聋小鼠模型。第二部分Connexin30基因敲除和条件诱导性Connexin26基因敲除小鼠耳蜗细胞的长时程损伤模式目的：研究Cx30基因敲除和条件诱导性Cx26基因敲除后小鼠耳蜗毛细胞、支持细胞及继发螺旋神经节细胞死亡的长时程损伤模式。方法：应用ABR分别检测Cx30基因敲除小鼠出生18天到18月龄（n=5），Cx26条件性敲除小鼠出生后18天到5月龄（n=5）不同时程对短波刺激（范围在4-32kHz）听力阈值的变化。使用耳蜗基底膜铺片DAPI染色绘制毛细胞耳蜗图定量观察毛细胞的损失（n=6）。小鼠耳蜗环氧树脂包埋，5μm连续中轴切片，使用点计数法定量观察螺旋神经节细胞不同时程的损失。结果：在Cx30敲除的小鼠中，出生后18天ABR显示在不同频率中听力损失在重度到全聋。听力损失随着时间的推移逐渐加重，到12月龄时全聋；大部分的内毛细胞，支持细胞和螺旋神经节细胞在18月龄时仍存活，最严重的损伤发生在外毛细胞和项回的螺旋神经节细胞，外毛细胞的损伤从底回向顶回逐渐发展。在Cx26条件诱导性敲除的小鼠中，听力的损失与Cx30基因敲除小鼠类似，出生后18天ABR显示在不同频率中损失在重度到全聋，听力损失随着时间的推移逐渐加重；耳蜗图显示，1月龄时在中回耳蜗Corti器所有的细胞均消失，随着时间延长损伤向底回和项回发展；大部分中回和底回的螺旋神经节细胞在出生前三月均消失，而项回有大量螺旋神经节细胞存活。在光镜下，这两种动物模型的内淋巴腔的大体结构和血管纹均未发现明显变化。结论：条件诱导性Cx26基因敲除小鼠耳蜗细胞的损伤和Cx30基因敲除小鼠相比发生得更迅速和广范，尽管Cx26和Cx30在耳蜗中共组装形成缝隙连接，在这两种基因敲除动物中耳蜗病理损伤模式的根本性不同提示Cx26和Cx30突变引起耳聋的机制并不一样。第三部分Connexin26对耳蜗发育和内淋巴电位形成的影响及机制目的：探索Cx26在内耳耳蜗发育和内淋巴电位形成中的作用。方法：通过在内淋巴电位形成的不同阶段腹腔注射TMX敲除Cx26，来研究Cx26对内淋巴电位形成的影响。注射TMX的时间点包括孕19天、出生后第2、第4、第6、第8、第10、第12和第16天。使用Cre报告基因小鼠Rosa26CreER／LacZ-stopLacZ染色来检测TMX注射后诱导Cre重组酶活化；使用western blot检测Cx26loxP／loxP；Rosa26CreER小鼠TMX注射后不同组Cx26在耳蜗Corti器，外侧壁和血管纹表达量的变化；孕19天注射TMX后，在出生第4、第8、第10、第12、第14、第18、第24和第30天使用5μm环氧树脂包埋切片观察耳蜗形态变化；使用ABR检测听性阈值变化。在出生第30天时检测所有组小鼠内淋巴电位的变化。结果：Rosa26CreER／LacZ-stop报告基因小鼠LacZ染色结果显示在第4天和第16天注射TMX后，Cre重组酶的活化没有差异。Western blots结果显示所有TMX注射后小鼠耳蜗Cx26的表达均降低。在出生后4天以前的小鼠敲除耳蜗Corti器中Cx26后，均出现耳聋，内淋巴电位下降，而在出生后4天以后敲除耳蜗Corti器中Cx26后，暂时并没有出现听力下降和内淋巴电位变化，而是早期出现了年龄相关性听力损失。在出生后4天以前注射的TMX的小鼠中，耳蜗发育过程中耳蜗Corti器Nuel隧道没有打开和形成。约出生后14天左右，耳蜗Corti器的细胞开始出现死亡，到出生后30天中回耳蜗Corti器中所有细胞均死亡。结论：Cx26对耳蜗内淋巴电位的形成和出生后耳蜗Corti器的成熟有重要作用。同时，Cx26对于基底膜上所有细胞的存活也有重要作用。第四部分小分子TrkB受体激动剂78-DHF对条件诱导性Connexin26基因敲除小鼠螺旋神经节细胞的保护作用目的：探讨应用一种新的小分子TrkB受体激动剂78-DHF对Cx26条件敲除小鼠中螺旋神经节细胞的保护作用。方法：对孕19天孕鼠给予腹腔注射TMX（0.1mg／g体重），次日新生的小鼠应用基因分型，挑选Cx26loxP／loxP；Rosa26CreER小鼠即条件诱导性Cx26基因敲除小鼠，Rosa26CreER小鼠作为同窝对照（n=5）。从出生后第2天开始至出生后30天，条件诱导性Cx26基因敲除小鼠实验组每天给予78-DHF腹腔注射（1g／ml，5l／g体重）（n=6）。20％DMSO／PBS腹腔注射条件诱导性Cx26敲除小鼠为空白对照组（n=5）。30天后耳蜗形态学的改变使用环氧树脂包埋切片观察（5μm）。毛细胞的损失使用耳蜗基底膜铺片myosinⅥ染色来观察（n=6）。听力阈值的改变使用ABR检测。结果：30天后，在给予20％DMSO／PBS腹腔注射条件诱导性Cx26基因敲除小鼠空白对照组中，中回耳蜗Corti器的细胞全部死亡，与同窝对照相比螺旋神经节细胞大部分死亡，螺旋神经节细胞相对密度为25.6％±4.7（n=5）。78-DHF腹腔注射条件诱导性Cx26基因敲除小鼠实验组中，中回耳蜗Corti器的细胞全部死亡，与同窝对照相比，螺旋神经节细胞完全存活，螺旋神经节细胞相对密度为90.0％±8.9（n=6）。ABR结果显示实验组与空白对照组4-32kH频率范围内均存在听力明显损失，实验组与空白对照组相比无显著性差异（P＞0.05）。结论：在Cx26条件敲除小鼠中小分子TrkB受体激动剂78-DHF对螺旋神经节细胞有显著保护作用。