近年来，太湖频繁爆发蓝藻水华，造成水质恶化和湖泊生态退化，成为影响水资源环境、制约经济与社会可持续发展的一个重要因素。研究显示太湖水华优势藻为微囊藻，但关于蓝藻、微囊藻、产毒微囊藻在太湖水华中的丰度、分布以及影响因素等生态特性研究极少，关于太湖产毒微囊藻类的产毒特性和产毒效率的研究尚未见报道。本研究拟建立基于全细胞PCR、RTQ-PCR技术、能对藻类环境丰度以及产毒能力进行测定与分析的检测方法；并对太湖水华藻的种类、环境生态特征以及太湖产毒微囊藻的产毒特性进行分析；进一步研究太湖土著斑点气单胞溶藻菌的溶藻作用与机制。预期结果为太湖水华的治理提供有效技术手段和重要基础数据。　　 一、基于PCR的蓝藻、微囊藻、产毒微囊藻及其产毒特性检测方法的建立　　 利用针对藻蓝蛋白中间基因序列（PC-IGS），微囊藻16s rDNA保守序列（Micr16s rDNA）以及微囊藻毒素合成酶基因B（mcyB）的特异性引物，以FACHH7806标准铜绿微囊藻为阳性藻株，建立检测蓝藻、微囊藻以及微囊藻毒素合成酶基因B的全细胞PCR检测法，并对全细胞PCR检测法的灵敏度、特异度进行测定。建立的全细胞PCR快速检测方法不受藻细胞生长时期的影响，也不受其它藻类细胞或杂菌的干扰。灵敏度测试结果表明，取10μL藻细胞样品为模板，在30μL反应体系中，PC-IGS的检测下限为1000cells/反应，mcyB的检测下限为10000cells/反应；在25μL反应体系中，Micr16s rDNA的检测下限为10000cells/反应。　　 应用SYBR GreenⅠ标记技术，与上述的PCR条件相结合，建立了实时荧光定量检测蓝藻、微囊藻属、产毒微囊藻在环境中的相对丰度的RTQ-PCR方法。该方法对蓝藻的检测范围为106-1011基因拷贝数/μL（R2=0.9941），微囊藻属的检测范围为104-109基因拷贝数/μL（R2=0.9936），微囊藻毒素合成酶基因B的检测范围为102-105基因拷贝数/μL（R2=0.9951）。蓝藻、微囊藻、微囊藻毒素合成酶基因B初始拷贝数与Ct值之间的线性关系曲线表达式分别为：Ct=-3.1466Lg Copy number+45.816，Ct=-3.0369Lg Copy number+42.551，Ct=-3.3120 Lg Copy number+31.297。　　 应用本实验室研究的SPE-HPLC提取、分析微囊藻毒素的技术，绘制MC-LR标准曲线，并对方法灵敏度、回收率和精密度进行测定，提出以单位藻细胞产MC-LR的量反映藻细胞的产毒能力的概念。结果显示，建立的HPLC检测法对MC-LR检测的浓度范围为0.1-10.0μg/mL，标准曲线为y=38.797x+17.536（r=0.9990），平均回收率为92.1％，变异系数为5.8％。　　 二、太湖水华优势藻环境特性的研究　　 利用全细胞PCR检测法对自太湖梅梁湾分离获得的两株藻株TH1、TH2进行鉴定，并结合HPLC、RTQ-PCR对产毒株TH1的产毒特性进行研究。结果显示，自太湖梅梁湾分离获得的TH1藻株为产毒微囊藻，TH2为不产毒微囊藻。培养15天的太湖产毒藻株TH1胞外藻毒素产量为0.085±0.017μg/108cells，总藻毒素产量为0.594±0.023μg/108cells。太湖产毒藻株TH1微囊藻毒素合成酶基因B的表达能力为FACHH7806标准铜绿微囊藻的1/16.826。　　 对太湖南泉水域进行了为期一年的水质、藻类环境丰度和产毒能力的监测与评价。结果表明，南泉水域的水污染程度与富营养化程度均为中度：5～11月总藻密度均超过水华阈值（106cells/L），9月份达到109cells/L_的最高值；微囊藻是太湖南泉地区的优势藻，其环境丰度维持在80～90％左右；产毒微囊藻的环境丰度在5～10月均高于40％，随着水温的下降，其环境丰度迅速降低并在12月降到了5.66％；总藻产MC-LR的能力在6、11月份，分别出现两个峰值；产毒微囊藻产MC-LR的能力为1.661～9.293μg/亿细胞。11～12月随着水温和藻密度的急速下降，产毒微囊藻产MC-LR的能力显著增强。结果提示太湖南泉水域全年大部分时间存在水华，微囊藻为其优势藻，产毒微囊藻的环境丰度及其产MC-LR能力的动态变化与水温密切相关。冬季产毒微囊藻产毒能力显著增强。因此，在水华和非水华期内，对有害藻华的防制都应予以重视。　　 三、斑点气单胞溶藻菌除藻作用与溶藻活性物质的研究　　 斑点气单胞菌对浓度为106cells/mL，的标准藻、太湖野生微囊藻TH1和TH2的48h溶藻率分别为65.82％、78.04％和82.67％。其溶藻活性随溶藻菌浓度升高而增强，104-107cells/mL的斑点气单胞菌48h溶藻率分别为16.25％、18.75％、48.75％、81.25％。其溶藻活性强弱与藻细胞初始浓度呈现负相关，对103-106个/mL藻细胞48h溶藻率分别为100％、100％、90.24％、80.46％。处于不同生长周期的斑点气单胞溶藻菌对藻细胞的溶解能力差异较大，对数生长期、稳定生长期、衰退期的斑点气单胞溶藻菌对106/mL，藻细胞48h溶藻率分别为30.54％、53.75％、72.50％。其对处于不同生长周期的铜绿微囊藻溶藻能力略有不同，对浓度为106/mL，处于对数期、稳定期、衰退期的铜绿微囊藻48h溶藻率分别为47.34％、53.41％、74.68％。温度对其溶藻影响较大，随着温度的升高，溶藻能力升高，15℃、25℃、35℃组对106/mL藻细胞48h溶藻率依次为25.35％、56.71％、72.73％。斑点气单胞溶藻菌主要通过分泌胞外活性成分来溶解藻细胞。在30-120℃范围内，温度升高有助于提高胞外活性成分的除藻能力。在pH5-9的范围内，偏碱性条件有助于提高胞外活性成分的除藻能力。石油醚、氯仿、乙酸乙酯等不同极性有机溶剂萃取实验结果表明，随着有机溶剂极性的升高，溶剂有机相萃取到的活性成分就越多。<2kDa活性组分48h溶藻作用是胞外滤液溶藻作用的87.27％。抗氧化测试发现胞外滤液在常温下放置4天后，溶藻活性降低了55％，而添加了1％的抗坏血酸（Vc）的胞外滤液溶藻率仅仅只下降了4％。乙醇沉淀实验显示乙醇提取液48小时的溶藻作用是胞外滤液溶藻作用的92.17％，而醇析沉淀物几乎没有溶藻作用。斑点气单胞菌胞外滤液中未检测到含有多糖、蛋白质、核酸、抗生素虽有检测到，但乙醇沉淀实验否定了活性物质为核酸的可能。　　 溶藻活性物质经5倍体积的无水乙醇4℃冰箱中过夜抽提，抽提液经离心（4000r/min，10min）后旋转蒸发待无水乙醇完全蒸发，经硅胶（100～200目）柱分离，以氯仿/甲醇=2:1、1:1、0:1进行梯度洗脱，得到两个主要溶藻组分。紫外（365nm）灯下可见两组分均呈现蓝紫色荧光，组分1呈淡黄色，不定型颗粒状，组分2呈棕黄色，油状。两组分均有一定的溶藻能力，但组分2的溶藻能力要强于组分1，推断斑点气单胞菌分泌的溶藻活性物质为多组分抑藻物质。官能团显色实验和紫外扫描结果提示斑点气单胞菌分泌的溶藻活性物质可能是含有苯环结构的胺类还原性物质。LC/MS-IT-TOF分析结果显示斑点气单胞菌分泌的溶藻活性物质含有两种主要成分，活性组分1、2的分子量分别为189.1232、166.0862，目前尚不能推断活性组分1的结构，初步判定活性组分2为苯丙氨酸，有关两种组分的分离、提取、纯化、鉴定还待进一步研究。活性物质的48h溶藻EC50为68.242μg/mL（FACHH7806藻细胞浓度：106cells/mL，反应温度：28℃，反应时间：48h）。95％可信区间为64.857μg/mL～71.892μg/mL。