目的:小胞外囊泡（small extracellular vesicles）是细胞外囊泡的一类主要成分,其作为细胞间信号传递的重要介质,能够在细胞间传递各种生物活性物质,是肿瘤细胞与肿瘤微环境相互作用的重要载体。本课题拟研究肿瘤细胞如何通过sEVs影响肿瘤微环境中的主要元素——成纤维细胞的功能,探究其在结肠癌发生发展中的作用机制。方法:1.利用聚乙二醇沉淀法提取结肠癌细胞上清中的sEVs,并通过透射电子显微镜（TEM）、粒径分析（NTA）和WB进行鉴定。2.将结肠癌细胞来源的sEVs与阴性对照分别加入成纤维细胞培养上清中,利用WB、免疫荧光（IF）技术检测成纤维细胞活化标志物的表达;利用Transwell迁移实验、细胞增殖实验CCK-8（Cell Counting Kit-8）、ELISA实验分别检测成纤维细胞的迁移能力、增殖能力和炎症因子的分泌水平。3.利用WB检测结肠癌细胞、结肠癌细胞来源的sEVs,以及成纤维细胞中的整合素β4（ITGB4）水平;利用免疫组化方法（IHC）分别观察人结肠癌组织和癌旁组织中的ITGB4水平;同时,利用WB分别检测癌组织和癌旁组织来源sEVs中的ITGB4的水平。4.利用ITGB4蛋白表达质粒（pcDNA3.1-ITGB4）转染成纤维细胞,上调细胞中ITGB4的蛋白水平后,利用WB、IF技术检测成纤维细胞活化标志物水平的改变;利用Transwell迁移实验、CCK-8实验、ELISA实验技术检测成纤维细胞的迁移能力、增殖能力和炎症因子的分泌水平,观察ITGB4蛋白对成纤维细胞功能的影响。5.利用Si-RNA-ITGB4转染结肠癌细胞,下调其ITGB4的表达后,利用聚乙二醇沉淀法提取其来源的sEVs,将含有低水平ITGB4和正常水平的sEVs分别加入成纤维细胞培养上清,利用WB、IF技术检测成纤维细胞活化标志物的表达,利用Transwell迁移实验、CCK-8实验、ELISA实验技术分别检测细胞的迁移能力、增殖能力、炎症因子的分泌水平,观察sEVs中ITGB4对成纤维细胞功能的影响。结果:1.TEM结果显示,sEVs呈典型的圆形的盘状囊泡结构,由双层脂质膜包裹,粒径直径约为100nm左右;NTA结果显示,sEVs的粒径直径在100-130 nm之间,分布均一;WB结果显示,sEVs表达细胞外囊泡的标志物CD63、TSG101,不表达内质网膜标志物,钙连蛋白（Calnexin）。2.结肠癌细胞来源的sEVs加入成纤维细胞培养上清后,成纤维细胞活化标志物α-SMA、FAP的表达水平升高,迁移能力增强,增殖能力增强,IL-6的分泌水平升高,IL-1β的分泌水平无显著变化。3.ITGB4蛋白在结肠癌细胞SW480及来源的sEVs中高表达,而在成纤维细胞中不表达;在临床组织标本中,ITGB4蛋白在结肠癌组织及其sEVs中高表达,而在癌旁组织及其sEVs中低表达。4.WB结果显示ITGB4蛋白表达质粒的转染使ITGB4在成纤维细胞中高表达,高表达的ITGB4可以促进成纤维细胞的活化标志物α-SMA、FAP的表达,增强其迁移能力,促进其IL-6、IL-1β的分泌,但未明显改变成纤维细胞的增殖能力。5.Si-RNA-ITGB4转染结肠癌细胞能显著降低细胞内和sEVs内的ITGB4,与对照sEVs相比,含有较低水平的ITGB4的sEVs,不能明显改变成纤维细胞活化标志物的表达水平,对成纤维细胞迁移,增殖能力的促进作用减弱,且促进炎症因子IL-6分泌水平升高的能力减弱。结论:结肠癌细胞来源的sEVs能够促进成纤维细胞活化标志物的表达,增强其迁移能力和增殖能力,并促进其炎症因子的分泌,使正常成纤维细胞的功能发生改变。并且,结肠癌细胞分泌的sEVs中的ITGB4蛋白分子在其改变成纤维细胞功能的过程中起着重要作用。