论文部分内容阅读
研究背景结直肠癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,目前发病率及死亡率仍位居较高水平。发掘新的分子指标、准确地对患者进行预后预测并提供进一步治疗是提升结直肠癌临床治愈率的关键。课题组前期研究发现,Obg-like ATPase 1(OLA1)缺失会引起小鼠胚胎发育延迟和器官体积减小,最终导致围产期死亡。大量研究表明,胚胎发育和肿瘤的发生发展在机制上存在相似性。OLA1在肺癌和乳腺癌的发生发展中均发挥重要作用,但其在结直肠癌中的功能尚未明确。因此,本文将通过临床资料分析、体内外实验以及分子生物学实验,阐明OLA1对结直肠癌疾病进展及预后的影响,并对其可能机制进行初步探究。研究内容和方法研究通过公共数据库、组织芯片及本中心样本库分析结直肠癌标本中OLA1的表达与患者临床病理特征、预后的关系,探索OLA1对结直肠癌进展以及预后的影响;通过稳转shRNA构建两株OLA1敲降的结直肠癌细胞系Hct116以及SW480,通过体内外实验研究OLA1对肠癌细胞系增殖、迁移等恶性生物学行为的影响;利用R2平台,从四个结直肠癌基因芯片中筛选与OLA1表达正相关的前1000个基因,用韦恩图提取共有基因并将目标基因在TCGA数据库中验证,找出OLA1可能的下游通路。之后,利用Western Blot、荧光共定位及核浆蛋白分离实验探究OLA1对YAP分子可能的影响;最后,研究基于DrugBank数据库模拟OLA1与已上市药物的结合构象,通过iGEMDOCK软件计算OLA1与药物的结合自由能,提取结合自由能前20位的药物作为OLA1可能的抑制剂。研究结果公共数据库分析显示,结直肠癌原发灶中OLA1在mRNA水平表达量显著高于正常黏膜;组织芯片及本中心样本库免疫组化和Western Blot结果进一步验证OLA1在肠癌组织高表达。多因素COX回归分析表明,OLA1是结直肠癌预后的独立危险因素之一,OLA1高表达提示患者预后不佳(HR:2.47,1.255-4.844,p=0.005)。在体外,OLA1敲降的肠癌细胞系Hct116及SW480在细胞增殖、克隆形成以及迁移能力上均显著弱于对照组细胞;在体内,OLA1敲降的Hct116在裸鼠皮下成瘤及肺转移能力上均显著下降。通过联合筛选及基于TCGA数据库的Spearmen检验,发现OLA1的表达与Hippo-YAP通路的关键分子YAP显著相关(r2=0.14,p<0.001);Western Blot表明,OLA1敲降引起结直肠癌细胞系YAP-397位点磷酸化水平下调;RT-PCR进一步验证OLA1敲降抑制YAP下游基因转录。最后,通过结合构象模拟计算,于DrugBank数据库内初步提取了结合自由能前20位的药物(如阿卡波糖、替米沙坦等)作为OLA1可能的抑制剂。研究结论1.OLA1能够促进结直肠癌的进展以及转移,是不良预后的独立危险因素;2.OLA1能够在细胞水平和动物模型水平促进结直肠癌的恶性表型;3.OLA1可能通过抑制YAP-397位点磷酸化,从而促进YAP入核激活下游靶基因转录引起结直肠癌的恶性生物学行为;4.通过计算机模拟,筛选出自由结合能前20位的药物(如阿卡波糖、替米沙坦等)作为OLA1可能的抑制剂。