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一、背景和目的:肝癌的发生是一个多因素、多步骤的复杂过程,原癌基因激活、抑癌基因失活、基因组不稳定性以及端粒酶激活在其发生、发展过程中起重要作用。其中,端粒酶因其在大多数肿瘤细胞中广泛存在而成为重要的肿瘤生物学标志。人端粒酶逆转录酶(human Telomerase Reverse Transciptase,hTERT)是端粒酶的催化亚单位和限速酶,对端粒酶活性维持起关键作用。文献报道,80%-100%的人肝细胞癌中hTERT过度表达。我们过去的研究表明,干扰hTERT表达可降低端粒酶活性,促进肝癌细胞凋亡和衰老,但其分子机制尚不清楚。线粒体是细胞内主要的ATP生产中心,可能在细胞凋亡控制中起主导作用。线粒体介导的细胞凋亡主要通过两个方面进行调控:一是保持ATP的产生;二是维持线粒体膜电位和线粒体膜通透性,调控特定的促凋亡因子从线粒体膜间隙进入到细胞质,但人们对其作用机制还不十分清楚。鉴于此,我们观察了经hTERT RNA干扰HepG2肝癌细胞线粒体膜电位变化、4种线粒体膜间隙促凋亡蛋白释放、端粒酶活性变化以及凋亡相关蛋白表达改变,希图对hTERT干扰通过线粒体途径促进凋亡的可能机制进行初步探索。二、方法:1、MTT法检测细胞生长曲线;2、流式细胞仪测定细胞凋亡和线粒体膜电位;3、激光共聚焦显微镜观察线粒体膜电位和凋亡细胞核改变;4、TRAP法检测转染细胞端粒酶活性变化;5、免疫细胞化学检测AIF和Endo G表达;6、Western Blot检测cyt C、Smac、Hsp60、AIF、Endo G、caspase-3、caspase-9、hTERT、XIAP、Bcl-2、Bax和Bcl-xl表达变化。三、结果1、与未转染细胞相比,第11代、20代、30代对照细胞和第11代、30代转染细胞生长略减慢,第20代转染细胞生长明显减慢;三代对照细胞组间比较生长速度无明显变化;三代转染细胞组间相比,第30代转染细胞生长最快,第11代次之,第20代明显减慢;2、第11代转染细胞与其对照细胞相比凋亡细胞百分比无显著差别(P＞0.05);第20代、30代转染细胞与对照细胞相比,凋亡细胞百分比明显增加(P＜0.05);第20代、第30代转染细胞分别与第11代转染细胞相比,凋亡细胞百分比明显增加(P＜0.05);第20代、第30代转染细胞组间相比无显著差别(P=0.051);HepG2未转染细胞和第11代、20代、30代对照细胞组间相比亦无显著差别(P＞0.05);3、FCM检测ΔΨm,第11代、20代、30代转染细胞和其对照细胞相比,去极化膜电位百分比明显增加(P＜0.05);第11代、20代、30代转染细胞随着细胞传代次数的增加去极化膜电位百分比逐渐增加(P＜0.05);HepG2未转染细胞和第11代、20代、30代对照细胞去极化膜电位百分比组间相比无显著差别(P＞0.05);4、共聚焦显微镜观察ΔΨm可见未转染细胞和对照细胞胞质中有大量小短棒状红色荧光,几乎未见绿色荧光;第11代转染细胞胞质内除大量红色荧光外出现少量绿色荧光;第20代、30代转染细胞可见红色荧光明显减少,同时出现大量均匀分布的绿色荧光,第30代绿色荧光比第20代进一步增加;5、第11代、20代、30代转染细胞和其对应的对照细胞相比,线粒体cyt C表达明显减少(P＜0.05),胞浆cyt C表达明显增加(P＜0.05);第11代、20代、30代转染细胞组间相比无明显差别(P＞0.05);未转染细胞与第11代、20代、30代对照细胞相比亦无显著差别(P＞0.05);6、第11代转染细胞与第11代对照细胞相比线粒体和胞浆Smac表达差别不显著(P＞0.05);第20代、30代转染细胞和其对照细胞相比,线粒体Smac表达明显减少(P＜0.05),胞浆Smac表达明显增加(P＜0.05);第30代比第20代转染细胞线粒体Smac表达减少(P＜0.05),胞浆Smac表达增加(P＜0.05);未转染细胞和第11代、20代、30代对照细胞相比则无显著差别(P＞0.05);7、免疫细胞化学检测AIF、Endo G表达可见未转染细胞、第11代转染细胞以及第11代、20代和30代对照细胞仅在胞浆中可见棕黄色(Endo G)或红褐色(AIF)着色;第20代、第30代转染细胞的胞浆和部分胞核中可见棕黄色或红褐色染色;8、第11代转染细胞与第11代对照细胞相比线粒体、胞浆和胞核AIF和Endo G表达无明显变化(P＞0.05);第20代、30代转染细胞和其对照细胞相比,线粒体AIF和Endo G表达明显减少(P＜0.05),胞浆AIF和Endo G表达无明显变化(P＞0.05),胞核AIF和Endo G表达明显增加(P＜0.05);第20代与第30代转染细胞相比则无明显差别(P＞0.05);未转染细胞与第11代、20代、30代对照细胞相比差别无显著性(P＞0.05);9、第11代转染细胞与其对照细胞相比线粒体、胞浆中Hsp60表达无明显变化(P＞0.05);第20代、30代转染细胞与其对照细胞相比,线粒体Hsp60表达明显减少(P＜0.05),胞浆Hsp60表达明显增加(P＜0.05);第20代与第30代转染细胞相比无明显差别(P＞0.05);未转染细胞与第11代、20代、30代对照细胞相比无显著差别(P＞0.05);10、第11代、20代、30代转染细胞与其对照细胞相比,hTERT和Bcl-2表达明显减少(P＜0.05),第11代、20代、30代转染细胞间相比无显著差别(P＞0.05);HepG2未转染细胞和第11代、20代、30代对照细胞相比差别无统计学意义(P＞0.05);11、HepG2未转染细胞、第11代转染细胞、第11代、20代和第30代对照细胞端粒酶活性未见明显改变;第20代、第30代转染细胞与其对照细胞相比,端粒酶活性均下降,且第30代转染细胞比第20代转染细胞端粒酶活性更低;12、HepG2未转染细胞、第11代、20代、30代对照细胞与第11代、20代、30代转染细胞相比,Bcl-xl表达均无明显差别(P＞0.05);13、第11代转染细胞与其对照细胞相比Bax和Caspase-3表达无显著差别(P＞0.05);第20代、30代转染细胞和其对照细胞相比,Bax和Caspase-3表达明显增加(P＜0.05);第20代、第30代转染细胞间相比差别无统计学意义(P＞0.05);HepG2未转染细胞和第11代、20代、30代对照细胞间相比差别不显著(P＞0.05);14、第11代转染细胞与其对照细胞相比XIAP表达无显著差别(P＞0.05);第20代、30代转染细胞与其对照细胞相比,XIAP表达明显减少(P＜0.05),第30代比第20代转染细胞表达减少(P＜0.05);HepG2未转染细胞和第11代、20代、30代对照细胞相比差别无显著性(P＞0.05);15、HepG2未转染细胞、第11代转染细胞、第11代、20代、30代对照细胞仅见前caspase-9一条带,第20代、第30代转染细胞可见前caspase-9及caspase-9 p35亚基两条带;16、HepG2未转染细胞、第11代转染细胞、第11代、第20代、第30代对照细胞可见胞核呈圆形或椭圆形,染色质分布不均匀,核仁明显;第20代、30代转染细胞可见部分细胞核缩小,染色质变致密,核仁缩小或消失,出现核浓缩和碎裂。四、结论1、hTERT干扰促HepG2细胞凋亡是一个缓慢的渐进过程。在此过程中,ΔΨm下降可能是细胞凋亡的早期改变(早于细胞膜和细胞核改变),并且一直贯穿于前30代转染细胞,随着ΔΨm逐渐降低,细胞凋亡逐渐增加;2、在hTERT干扰促HepG2细胞凋亡过程中,ΔΨm降低可能促进线粒体IMS促凋亡蛋白由线粒体释入胞浆,且cyt C释放早于Smac、AIF、Endo G释放;3、在hTERT干扰促HepG2细胞凋亡过程中,ΔΨm下降早于端粒酶活性降低,推测hTERT可能存在不依赖端粒酶活性改变的其它机制调节细胞凋亡;4、在hTERT干扰促HepG2细胞凋亡过程中,Bcl-2和Bax共同参与线粒体IMS蛋白释放的调节,且Bcl-2可能是Bcl-2家族蛋白通过线粒体途径调节细胞凋亡的始动因素;未见Bcl-xl参与此凋亡过程;5、在hTERT干扰促HepG2细胞凋亡过程中,线粒体基质蛋白Hsp60和线粒体IMS蛋白均由线粒体释入胞浆,提示IMS蛋白可能通过PT孔释放;6、在hTERT干扰促HepG2细胞凋亡过程中,cyt C和Smac释放后通过不同的途径共同参与caspase-3的激活:释放的cyt C通过cyt C/Apaf-1/procaspase-9途径活化caspase-9,进而激活caspase-3;释放的Smac则可能通过抑制XIAP表达,直接或/间接促使caspase-3表达增加;7、在hTERT干扰促HepG2细胞凋亡过程中,AIF、Endo G由线粒体释放到胞浆后转入细胞核内直接引起胞核浓缩和DNA片段化。