论文部分内容阅读
伪狂犬病(PR)是一种对猪等哺乳动物具有重大经济影响的病毒性疾病,一旦爆发,将会对全世界养猪行业造成巨大的经济损失。目前,接种伪狂犬病疫苗是绝大多数发展中国家控制和预防PR最有效的方式之一。由于伪狂犬病病毒(PRV)具有泛嗜性,对多种哺乳动物细胞敏感,常将PRV接种BHK-21细胞、PK-15细胞及Vero细胞等进行扩增并生产PR灭活病毒疫苗。随着新型PRV变异株的出现导致中国猪群中PRV感染情况恶化以及畜牧业的飞速发展,PR灭活病毒疫苗的需求量剧增。而现阶段我国PR灭活病毒疫苗的生产工艺主要存在工艺不稳定及企业生产效率低下等问题,相对落后的滚瓶工艺以及反应器微载体悬浮工艺生产PR灭活病毒疫苗是导致目前企业生产效率低下的主要原因。因此,采用生物反应器无血清悬浮培养哺乳动物细胞高效扩增PRV是解决当前问题的关键。所以,建立稳定可行的无血清悬浮培养动物细胞高效扩增PRV的生产工艺,对于减轻PR在中国养猪行业造成的经济损失是非常有必要的。本文首先以自主开发的培养基以及自主悬浮驯化的对PRV较为敏感的BHK-21细胞、PK-15细胞及Vero细胞为研究对象,考察以上三种备选细胞在各自生长培养基中的生长情况及对PRV的敏感性,进而进行病毒感染复数(MOI)及接毒时活细胞密度优化,获得以上三种细胞各自对应的优化后的MOI和活细胞接毒密度工艺参数。然后根据细胞的生长特性和接种PRV所达到的病毒滴度以及后续工艺放大过程中操作的简单性、生产效率等因素,对增殖速度最快的BHK-21细胞进行进一步的工艺优化,包括种毒代次、接毒操作方式以及流加工艺等。发现当MOI为0.0005、活细胞密度为3×106 cells/ml、种毒为P1代、1:2稀释接种且流加3%比例的BHK-21细胞流加培养基,PRV滴度为9.25 1gTCID50/ml,较优化前提高了 0.92 1gTCID50/ml。并对建立的PRV扩增工艺进行同一条件下10批次验证实验,得出最大PRV滴度稳定在(9.30±0.12)lgTCID50/ml,最大PRV滴度的标准差为0.12,相对标准偏差为1.27%,表明所建立的PRV扩增工艺稳定性良好。在此基础上,通过冷模实验探究了 pH对PRV滴度的影响,确定了 PRV的最适pH为6.90-7.10。最后将建立的PRV高效扩增生产工艺于3 L生物反应器中进行验证,获得的PRV滴度为9.33 lgTCID50/ml。表明建立的PRV高效扩增工艺在3 L生物反应器规模中是可行的,为后续进一步过程放大以及实现PR灭活病毒疫苗的高效率生产奠定了基础。