论文部分内容阅读
目的探讨TGF-β1介导的Rho/ROCK信号通路对HK-2细胞紧密连接的影响。方法(1)用TGF-β1 (5ng/ml)刺激人肾小管上皮细胞(HK-2),采用Western Blot法观察0、15min、30min、1h、4h、12h的总RhoA及活化RhoA蛋白表达,采用Real time PCR、Western Blot及间接免疫荧光法分别观察0、12h、24h、48h的紧密连接蛋白Occludin和ZO-1mRNA及蛋白表达。(2)将HK-2细胞分成正常对照组、TGF-β1 (5ng/ml)刺激组和TGF-β1刺激(5ng/ml)+Y-27632(10μM)干预组分别干预48h,采用Real time PCR、Western Blot及间接免疫荧光法分别观察Occludin和ZO-1的mRNA及蛋白表达。结果(1)经TGF-β1刺激后,HK-2细胞总RhoA蛋白表达无明显改变；活化RhoA于15分钟即出现活性升高,1小时达高峰,4h开始减弱,12h仍高于0时间点,与0时间点比较分别为(2.82±0.57)倍、(4.06±0.54)倍、(3.44±0.31)倍、(3.01±0.44)倍,P值均小于0.05。(2)经TGF-p1刺激后,Real time PCR显示Occludin和ZO-1mRNA表达均呈时间依赖性降低,其中24h、48h P<0.05。Western Blot及间接免疫荧光法均显示Occludin和ZO-1蛋白表达均呈时间依赖性降低,其中24h、48h P<0.05。(3)经ROCK特异性抑制剂Y-27632干预后,Real time PCR显示Occludin和ZO-1mRNA表达较TGF-β1刺激组明显升高(P<0.05),Western Blot及间接免疫荧光法均显示Occludin和ZO-1蛋白表达水平较TGF-β1刺激组明显升高(P<0.05)。结论(1)TGF-β1能诱导HK-2细胞Rho/ROCK信号通路活化。(2) TGF-β1介导的Rho/ROCK信号通路可通过下调HK-2细胞紧密连接蛋白表达促进EMT。