[背景和目的]勃起功能障碍(erectile dysfunction, ED)是指阴茎勃起硬度不足以插入阴道或维持时间不足以圆满完成性交。最新研究发现,ED的发病率在不到40岁男性患者为1%-10%、40到49岁为2%-9%、60到69岁为20%-40%,而超过70岁的男人则高达50%-100%。ED是糖尿病(diabetes mellitus, DM)患者常见的并发症,糖尿病是ED最危险的因素,由糖尿病诱发的ED称之为糖尿病性勃起功能障碍(diabetes-induced erectile dysfunction, DIED)。目前DIED的治疗种类虽多,但均有缺陷,如疗程长、疗效不确切、费用高昂、尤其是很大一部分DIED患者对一线药物(5型磷酸二酯酶抑制剂,phosphodiesterasetype5inhibitors,PDE5i)不敏感而又不能或不愿意接受二线(如真空勃起装置)和三线治疗(阴茎假体置入)方案等。因此,探索更理想的方法是DIED临床治疗的迫切需求。阴茎海绵体平滑肌(Corpus cavernosum smooth muscle, CCSM),作为阴茎海绵体窦状间隙舒张和阴茎勃起的结构基础,在阴茎勃起过程中对血流动力学改变发挥重要的作用,任何引起CCSM组织或细胞损伤的因素,均可能导致患者ED的发生。有学者提出,糖尿病引起的CCSM细胞数量减少、细胞超微结构发生病理改变及细胞舒缩功能受损是导致ED发生的重要原因。我们也已证实糖尿病性ED大鼠的阴茎海绵体组织及细胞中,平滑肌细胞(SMC, smooth muscle cells)标记物、收缩相关因子a肌动蛋白(SMa-actin, SMA)、平滑肌细胞肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain, SMMHC)、肌滑蛋白(smoothelin)、碱性调宁蛋白(calponin)表达明显下降,CCSM细胞数量减少及细胞舒缩功能受损。因此,DIED的发生与CCSM细胞的病理改变和缺失密切相关,目前尚缺乏从根本上改善这些病理状态的理想方法。随着基因工程技术和干细胞技术的不断发展和应用,给解决这一难题带来了希望。脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)具有自我更新和多向分化潜能,经诱导后在体外可分化为多种细胞,取材方便,由脂肪组织提取后增长速度较快,可自体移植。同时,ADSCs具有诱导多向分化性和表观修饰后能表达特定外源目的基因,其无论在体内还是体外都具有很强的可塑性,用诱导分化后的ADSCs来替代病理改变或缺失的细胞,恢复组织和器官的生理功能,达到治疗疾病的目的,可行性强,应用前景广阔,被认为是未来再生医学中较为理想的种子细胞。Myocardin是一种核受体转录因子蛋白,在SMC分化过程中发挥重要的调控作用,其调控SMC分化的机制主要是通过与血清效应因子(serum response factor, SRF)结合而发挥作用。有学者将Myocardin基因修饰的骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells, BMSCs)注入心肌梗死小鼠模型的梗死部位,发现Myocardin基因修饰的BMSCs向平滑肌样细胞分化,同时发现小鼠左室功能明显提高。另外,Madonna等人使小鼠ADSCs高表达myocardin A (Myocardin的一个亚型),结果发现经基因修饰的ADSCs在一定时间内会出现肌细胞样收缩,进一步分析发现这些细胞均表达SMA。大量研究发现,基因修饰干细胞治疗ED较单纯基因治疗和干细胞治疗更具优势。基因修饰干细胞治疗是利用载体将目的基因转移到干细胞内,使干细胞获得新的性状,再通过体内回输而矫正体内异常的基因表达和病变细胞,从而达到治疗疾病的目的。慢病毒载体由于具有携带基因片段容量大,转染效率较高,目的基因可在宿主细胞中长时间稳定表达,以及安全性好等诸多优点,现己成为转移目的基因的理想载体。因此,我们认为若将myocardin基因修饰后的ADSCs移植到阴茎海绵体内,通过增加CCSM细胞的数量及修复其舒缩功能,无疑将会使DIED的治疗达到一个新的高度,但目前国内外还未见有此方面的报道。本研究从体外探讨myocardin基因转染对大鼠ADSCs分化的影响,并对该基因在ADSCs向SMC分化中的作用及其机制进行相关研究,为进一步研究采用myocardin基因修饰ADSCs移植治疗DIED奠定理论基础。[方法]1.大鼠附睾旁ADSCs的体外分离培养及生物学特性研究在SD大鼠麻醉状态下,取其两侧附睾旁脂肪组织,将其洗净、剪碎后,使用胶原酶消化贴壁筛选法进行原代培养,细胞生长融合至80%左右时进行传代培养；对ADSCs进行冻存、复苏实验；MTT检测P3、5、7代及冻存复苏后ADSCs的生长活力,并绘制生长曲线；取P3代和冻存复苏后的ADSCs,分别行多向分化潜能鉴定和表面分子标记CD29和CD44的鉴定。为本课题组利用ADSCs作为种子细胞治疗ED等泌尿男科疾病的研究奠定基础。2. Myocardin基因重组慢病毒载体构建及其在大鼠ADSCs中的表达使用全基因合成技术的方式人工合成大鼠myocardin基因,构建其重组慢病毒载体pLVX-IRES-Neo-myocardin,并对其进行酶切鉴定及测序鉴定；提取重组质粒pLVX-IRES-Neo-myocardin,与包装质粒共同转染293T细胞包装出含有目的基因myocardin的慢病毒颗粒,同时包装出空载体病毒颗粒,分别测定其病毒滴度。将大鼠ADSCs分为实验组(pLVX-IRES-Neo-myocardin+ADSCs),空载对照组(pLVX-IRES-Neo+ADSCs)及空白组(ADSCs),分别用重组慢病毒和空载体病毒感染72h后,采用RT-QPCR和Western blot检测各组ADSCs中myocardin mRNA和蛋白的表达情况,并进行统计学分析。为应用携带myocardin基因的ADSCs移植治疗糖尿病性ED奠定实验基础。3. Myocardin基因在大鼠ADSCs向SMC分化中的作用及机制分别将重组慢病毒颗粒pLVX-IRES-Neo-myocardin和空载体病毒颗粒pLVX-IRES-Neo转染大鼠ADSCs, G418筛选2周后,使用免疫荧光(IF)检测转染后细胞中SMA。SMMHC。smoothelin、calponin、myocardin和SRF的表达情况RT-QPCR检测转染后细胞中SMA、SMMHC、smoothelin和calponin mRNA的表达情况,并行统计学分析；Western blot检测转染后细胞中SMA、SMMHC和myocardin的表达情况,并行统计学分析；Ⅰ型胶原格栅细胞收缩力测定法检测转染后细胞的收缩力；免疫共沉淀(IP)检测转染后细胞中myocardin与SRF之间是否存在相互作用。在体外,从细胞和分子水平探讨myocardin基因在大鼠ADSCs向SMC分化中的作用,并探讨其部分机制。为接下来从动物和整体水平,观察myocardin基因修饰的ADSCs移植,对糖尿病性ED大鼠阴茎勃起功能的影响及其相关机制的研究提供理论依据。[结果]1.大鼠附睾旁ADSCs的体外分离培养及生物学特性研究体外培养的ADSCs易扩增、增殖迅速,.原代细胞呈短梭形或多角形,传代后以长梭形为主,呈旋涡状或束状排列,形态均一,成纤维样细胞生长。细胞经过多次传代后仍能保持较强的增值能力,其生长曲线呈“S”形。经成脂诱导液培养后,表现出脂肪细胞特性,油红O染色示胞浆内有脂滴出现；经成骨诱导液培养后,表现出成骨特性,茜素红染色出现钙化结节。流式细胞仪检测结果可见ADSCs中CD29和CD44分子阳性率高,CD29阳性率87.2%、CD44阳性率93.5%；ADSCs在液氮中冻存3个月后复苏,其活力仍保持较好,存活率也较高。2. Myocardin基因重组慢病毒载体构建及其在大鼠ADSCs中的表达所获myocardin基因测序证明与Gene Bank中序列一致,重组慢病毒载体质粒pLVX-IRES-Neo-myocardin经酶切及测序鉴定为正确克隆,并包装出病毒,其中重组慢病毒的滴度为2.3×109cfu/ml,空载体对照慢病毒的滴度为4.6×109cfu/ml。重组慢病毒转染大鼠ADSCs后行RT-QPCR和Western blot检测,结果显示三组细胞均有myocardin mRNA和蛋白的表达,其中,在实验组myocardin mRNA和蛋白的相对表达水平明显高于空载对照组和空白组,实验组与空载对照组和空白组之间存在显著差异(P<0.05),而空载对照组和空白组之间无显著差异(P>0.05)。3. myocardin基因在大鼠ADSCs向SMC分化中的作用及机制IF检测到经myocardin基因修饰的ADSCs较强表达SMC特异性标志蛋白SMa-actin、SMMHC、smoothelin、calponin及myocardin和SRF,空载对照组的表达则较弱；RT-QPCR结果发现,实验组与空载对照组中均可检测到SMa-actin、 SMMHC、smoothelin和calponin mRNA的表达,且在实验组中SMA、SMMHC、 smoothelin和calponin mRNA的表达水平明显高于空载对照组,两组之间均存在显著差异(P值分别为0.000、0.001、0.000、0.001)；Western Blot结果也证实,两组细胞中均可检测到myocardin、SMa-actin和SMMHC蛋白的表达,且在实验组中,myocardin、SMa-actin和SMMHC蛋白表达明显高于空载对照组,两组之间存在显著差异(P值均为0.000)。由此提示,myocardin基因可促进ADSCs向SMC分化。细胞收缩力测定结果得出,在血清及钙离子运载体Calcium-Ionophore作用下,与空载对照组相比,实验组细胞收缩力明显增强(P=0.001)。IP结果发现,实验组和空载对照组均可以检测到myocardin和SRF复合物的形成,但实验组相互作用明显更强。[结论]1.使用胶原酶消化贴壁筛选法从大鼠附睾旁脂肪组织分离培养得到的细胞的确为ADSCs,较纯,生长速度快,且具有间充质干细胞特性,即能黏附到塑料制品上、具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的多向分化潜能,并且能表达特殊的干细胞表面抗原。2.成功构建携带myocardin基因的重组慢病毒载体pLVX-IRES-Neo-myocardin,该载体得以病毒包装,并获得滴度为2.3×109cfu/ml的高感染力病毒。3.成功实现了外源性基因myocardin在SD大鼠ADSCs中的表达。4.在体外,myocardin基因可促进ADSCs向SMC分化。5.经myocardin基因修饰后的ADSCs,其收缩力明显增强。6. Myocardin与SRF的相互作用在myocardin基因诱导大鼠ADSCs向SMC分化过程中起着重要作用。