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病毒样颗粒(Virus like particles,VLP)是多个蛋白质亚基组装而成的纳米颗粒,有望发展成为各种疫苗抗原、佐剂或药物载体,是近年来生物制药工程领域的热点之一。本文以乙肝核心抗原病毒样颗粒(Hepatitis B core antigen virus-like particles,HBc-VLP)为研究对象,在已有的蛋白质研究方法之上,对其进行颗粒学研究,建立了适合其批量制备的纯化工艺,探索了其作为疫苗抗原和药物载体的应用。主要研究结果如下:(1)分析了 HBc-VLP颗粒表面结构性质,利用其表面强疏水性的特点,建立了基于疏水层析的批量制备HBc-VLP的技术。以疏水层析纯化为核心,以60℃加热30min预处理为前级分离,以凝胶过滤层析为后级精制,从发酵培养后破菌上清液中分离纯化HBc-VLP,总收率41.92%,纯度大于99%,是迄今为止文献上报道的全套HBc-VLP分离纯化工艺。先后进行6批次发酵液的层析纯化,产品收率和纯度重现性良好。(2)根据结构同源性模拟计算了 HBc-VLP与三种衍生物颗粒表面疏水值的差异,优化了疏水层析条件,采用(1)中建立的HBc-VLP纯化工艺,成功地从发酵后细胞破碎上清液中纯化出高纯度的M2e-HBc、NP-HBc和OVA-HBc。其中,三种衍生物M2e-HBc、NP-HBc和OVA-HBc均以HBc-VLP为骨架,分别通过基因融合的方式插入了流感病毒基质蛋白M2e、流感病毒核蛋白NP和模型抗原卵清蛋白OVA三种抗原表位。(3)从颗粒变化的角度对纯化工艺中的前处理步骤进行了考察,发现当加热处理菌体破碎液沉淀宿主蛋白时,HBc-VLP在高于70℃处理后颗粒尺寸和分子量都有增加,而低于70℃处理就没有这种现象发生。仔细分析发现,HBc-VLP具有热敏可逆膨胀性,温度升高,亚基与亚基间孔道扩张,颗粒尺寸增大;但温度恢复常温后,尺寸也能复原。但是当温度大于70℃后,孔道扩张足够大,使得细胞破碎上清液中大量杂质蛋白能够通过孔道,而VLP是中空的颗粒,进入颗粒内部的杂质蛋白在颗粒内部积累,并在热处理后仍然驻留在颗粒内部,导致VLP尺寸增加和分子量增大。(4)建立了两步加热预处理的策略。第一步在60℃加热30min以沉淀去除菌体破碎上中大部分杂质蛋白,第二步升高到70℃加热30 min进一步沉淀残留的杂蛋白。两步加热的策略有效避免了一次升高到70℃出现的大量杂质进入颗粒的问题,HBc-VLP收率达到85.8%,纯度74.7%。耦合一步疏水层析精制使纯度达到99.0%,整个工艺收率77.7%。新工艺用于HBc-VLP的衍生物的纯化亦获得成功,M2e-HBc、NP-HBc和OVA-HBc的纯度都达到97%以上,收率均在50%以上。(5)根据上面HBc-VLP在高温下颗粒尺寸膨胀、亚基之间孔道加大的发现,设计了高温装载抗原的应用过程。将纯化后的M2e-HBc(表面融合流感基质蛋白M2e)作为流感疫苗的候选,通过加热法使流感病毒核蛋白抗原表位多肽(NP)进入到M2e-HBc颗粒中,构建了一种表面、内部都具有抗原的流感疫苗。免疫小鼠后,ELISA法检测针对M2e/NP的抗体,抗体水平较对照组有明显提升;A/FM/1/47(H1N1)流感病毒进行攻毒实验,内外双抗原流感疫苗保护率能够达到100%。(6)将加热装载法拓展到装载抗癌药物的应用上,以纯化的HBc-VLP为抗癌药物阿霉素(DOX)的载体,通过70℃加热90 min实现每个HBc-VLP分子装载4248个DOX,优于传统方法的装载效率。利用HBc-VLP多对二硫键对谷胱甘肽敏感的特性,实现阿霉素在肿瘤细胞内的控释。HBc-VLP表面化学修饰RGD靶向肽,达到特异性靶向的目的,取得了比传统给药更好的抑瘤效果。