【摘 要】
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目的利用常间回文重复序列丛集(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)系统敲除小鼠肾内髓集合管3(m-IMCD3)上皮细胞的水通道蛋白2(Aqp2)基因。方法1.在小鼠Aqp2基因的第1、4个外显
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目的利用常间回文重复序列丛集(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)系统敲除小鼠肾内髓集合管3(m-IMCD3)上皮细胞的水通道蛋白2(Aqp2)基因。方法1.在小鼠Aqp2基因的第1、4个外显子上各设计两个小向导RNA(sgRNA),分别为sgRNA1-1、sgRNA1-2、sgRNA4-1、sgRNA4-2,并将其成功克隆进lentiCRISPR V2载体上。2.采用脂质体转染法将测序正确的质粒转染到m-IMCD3细胞中。3.用含5μg/ml的嘌呤霉素培养基筛选细胞,直至对照组细胞全部死亡后,换成含1μg/ml的嘌呤霉素培养基培养细胞。4.提取各单克隆细胞系的基因组DNA。5.以提取的单克隆细胞系的基因组为模板,通过聚合酶链式反应扩增出sgRNA作用靶点的DNA片段并测序。6.设计Aqp2、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物,利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测Aqp2 mRNA的表达。7.利用免疫荧光检测细胞系Aqp2的表达。结果1.成功构建出含有相应sgRNA的载体;2.成功获得筛选细胞;3.4个sgRNA对Aqp2基因的靶点都有切割作用;4.sgRNA1-1与sgRNA4-2组合能成功把两者间5500 bp的DNA片段敲除;5.应用RT-PCR及免疫荧光证实应用CRISPR/Cas9系统敲除Aqp2后,该m-IMCD3细胞系中的Aqp2 mRNA及蛋白几乎未见表达。结论通过CRISPR/Cas9系统可获得Aqp2基因敲除的肾集合管上皮细胞系。
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