论文部分内容阅读
辣椒是世界五大蔬菜之一,可用作蔬菜、调料、色素、药用等用途。它的种植面积十分广泛,仅次于大白菜居第二位,但其产值却居第一位.辣椒原产中南美洲,主要有五大栽培种。其中C.annuum是最为重要的一个栽培种种,它能同时在热带和温带地区生长,而且具有多样化的特性。相比而言,其余四大种则只能在特定的环境下生长或只能在热带地区生长,并且大多用来做调料。辣椒疫病(Phytophthora capsici.L)是世界性病害,严重影响辣椒的产量和品质。本试验以辣椒高抗疫病材料PI201234和高感疫病材料G29及其构建的F2群体为研究试材,采用前人筛选的EST-SSR引物,使用SSR分子标记技术构建遗传连锁图谱,并结合F2群体的抗疫病生物学鉴定,对辣椒抗疫病性进行相关QTL定位,同时还对F2构建的抗、感基因池进行了转录组测序分析。主要结论如下:1.辣椒抗疫病鉴定本试验采用游动孢子灌根法进行辣椒抗疫病鉴定。病原菌为江苏淮安地区分离株,属于生理小种Ph1。在PDA上活化后转入V8培养基,28℃黑暗条件下培养5~7d后,长日照培养2-3 d以诱导产生孢子囊,然后加入无菌水,4℃放置40min后室温30min释放游动孢子,制备浓度为1×104个/mL的孢子悬浮液。以辣椒高抗疫病材料P1201234和高感疫病材料G29为亲本构建F2群体,在6-8叶期进行游动孢子灌根接种,每株20mL,塑料薄膜保湿24 h后转移至人工气候箱,在温度28℃,相对湿度90%,光照4000 lx,12h/d的条件下培养促使发病。接种15d后统计结果表明,发现辣椒发病趋势呈现偏正态分布,其中0级辣椒10株,1级辣椒16株,2级辣椒30株,3级辣椒33株,4级辣椒31株,5级辣椒28株。2.辣椒抗疫病遗传连锁图谱的构建以抗疫病材料P1201234和感疫病材料G29构建的F2群体为作图群体,利用EST-SSR分子标记构建遗传连锁图谱。首先利用抗、感亲本对664对EST-SSR引物组合进行筛选,共获得了具有多态性的引物114对,再经过F2部分单验证,选取65对多态性稳定、条带清晰的引物组合对F2进行基因分型。应用JoinMap 4.0软件对结果进行分析,以LOD值≥2作为阈值,利用‘’Kosambi"作图函数,构建了一张包含10个连锁群,49个EST-SSR标记的辣椒遗传连锁图谱。连锁群总长度为418.6 cM,平均每个连锁群上标记数在2-12个之间,两标记间的平均遗传距离为8.55 cM。3.辣椒抗疫病相关QTL定位运用MapQTL 4.0软件的复合区间作图法进行QT]L分析。在构建的辣椒遗传连锁图谱的基础上结合抗疫病生物学鉴定,在N3连锁群上检测到1个QTL位点,该QTL位点LOD值为2.45,在连锁群上的支持区域是0~5.0cM,距离最近的标记ESTSSR451是5.0 cM,可解释表型差异的贡献率为14.9%。4.辣椒转录组测序分析辣椒总RNA纯化得到mRNA,打断mRNA反转录成不同片断大小的DNA,用Ⅱumina HiseqTM 2000进行测序。再利用原始reads(双端序列)组装该物种的Unigene Library(Unigene库),基于Unigene库进行基因结构注释、基因表达分析、基因功能注释等。测序共获得44.6 Gb数据量,其中reads数220,810,807条,CycleQ20达到100%。Unigene中有77,333条,基因表达注释分析中,93,307条Unigene注释NR数据库;86,638条注释到NT数据库;55,955条注释到Swiss-Prot数据库;49,247条注释到KEGG数据库;28,925条注释到GOG数据库;73,831条注释GO数据库,丰富了陆地棉黄萎病菌诱导的的转录组信息。并对其中22043-2303bp序列和25545反序列进行了核苷酸和蛋白质BLAXT分析,结果表明,这两个序列与马铃薯抗病基因有校大程度的同源性。