本文研究工作主要包括两个方面：一方面是刺糖多孢菌原生质体的电转化条件与转化效率的研究；另一方面是利用聚乙烯亚胺(PEI)和葡聚糖硫酸酯(DS)，制备PEI-DNA-DS纳米颗粒，研究纳米颗粒对毕赤酵母电转化效率的影响。刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)属糖多孢菌属，是一种好氧型革兰氏阳性放线菌。首次发现于土壤中。刺糖多孢菌经有氧发酵后能够产生次级代谢产物—多杀菌素。多杀菌素是一种新型大环内酯类化合物。主要活性成分为spinosynA和spinosyn D。因其具有低毒性、低残留、快分解等特点，兼具化学农药的高效性与生物农药的安全性，曾两次荣获美国“总统绿色化学品挑战奖”。对农业害虫有着极好的杀虫效果，而对哺乳动物、鱼类、鸟类和大多数益虫等非靶标生物具有极高的安全界限，是一类最具发展前景的新型高效生物杀虫剂，应用前景巨大。但是受到本身菌种的限制，发酵周期长，产量低下，提高了生长成本，限制了其在生产中的应用。因此，通过基因工程手段对其进行遗传改造，构建具有良好遗传稳定性的高产菌株，对于经济生产和环境保护都具有重要价值。由于刺糖多孢菌自身具有严格的限制修饰系统，对外源DNA有很强的限制修饰作用，阻止外源基因的有效转化，导致重复性差，转化效率也很低，因此，建立稳定的遗传转化系统十分必要，是进行菌株改造以及基因分析等研究的前提。本文建立了稳定的刺糖多孢菌电转化系统，为进一步利用基因工程技术对其进行改造奠定了基础。本文建立刺糖多孢菌S.spinosa49460原生质体制备与再生最佳条件，探索了电转化方法的最佳条件。首先，制备电转化所需的原生质体，通过对菌体生长时间、溶菌酶浓度、处理温度以及作用时间进行单因素研究，确定了能够制备高质量原生质体的方法。实验结果表明，制备原生质体时，将刺糖多孢菌接种于50ml CSM(含0.2%甘氨酸)液体培养基中，28-30°C振荡培养72h后，经浓度为1.5mg/ml的溶菌酶在32°C下酶解60min时，形成的原生质体数目最多，而且再生能力强。将制备的原生质体用于电转化研究中。对质粒DNA的浓度、电压和电阻等条件进行优化。成功获得了转化子，经基因组PCR验证了转化体系的有效性。并且转化效率会因菌株和质粒的不同而存在较大差异。本文第二部分是有关DNA-PEI-DS纳米颗粒提高毕赤酵母转化效率的研究。作为真核表达系统，毕赤酵母常用于表达分泌型外源蛋白。不仅生长速度快、易于培养，而且还能对目的蛋白进行糖基化修饰和翻译后修饰及空间折叠等功能。毕赤酵母能够利用甲醇诱导的醇氧化酶AOX1基因启动子，经过高密度发酵后，再通过甲醇诱导，高效表达外源蛋白。本文以毕赤酵母GS115为研究对象，其基因组内含有2个醇氧化物酶编码基因：AOX1和AOX2基因，甲醇利用能力和野生型相同，所以转化子为HIS+Mut+表型，而当外源基因通过重组替换，使染色体上缺失了AOX1基因，只存在AOX2基因，在以甲醇为碳源的培养基中生长很慢，此时菌株表型为HIS+Muts。然而，在毕赤酵母转化过程中，经常遇到转化效率和重组效率低的问题。研究发现：利用PEI和DS对外源转化的DNA预处理后，得到的PEI-DNA-DS纳米颗粒明显地提高了毕赤酵母电转化效率。同样地，在不同电压、电阻，毕赤酵母不同细胞周期以及DNA浓度几个方面证实了毕赤酵母在电转化中整合效率的提高。本论文重点研究了DNA-PEI-DS纳米颗粒制备条件，研究了不同电转化条件下，DNA-PEI-DS电转化效率。结果表明：当培养的毕赤酵母细胞浓度达到OD6000.3-0.8时，将DNA进行PEI和DS预处理，PEI/DNA为5:1，得到DNA-PEI-DS纳米颗粒，用于电转化。当DNA含量为100ng，得到的转化子最多。