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红掌是具有重要观赏价值和经济价值的花卉,具有广阔的市场前景。红掌新品种选育主要途径是杂交育种,但是目前我国现有的品种大多为杂交品种,基因杂合性高,花粉育性低,通过杂交育种方法选育新品种效率低。植物基因工程的发展和应用为红掌育种开辟了一条新途径。根癌农杆菌介导的遗传转化主要依赖于遗传转化受体系统的优劣及农杆菌的侵染效率。因此,能否建立高效的遗传转化受体系统,是成功进行遗传转化的关键。本研究以商品化的红掌盆栽品种Pink Champion为材料,研究提高红掌愈伤组织诱导率和植株再生率的措施,建立了红掌遗传转化受体系统;在此基础上,采用根癌农杆菌介导法,以红掌愈伤组织为转化受体,研究影响转化效率的因素,建立了农杆菌介导的红掌遗传转化体系。主要研究结果如下:
1.基因型对愈伤组织的诱导有显著的影响。Pink Champion叶片愈伤组织诱导率最高,为90%。基本培养基对愈伤组织的诱导有显著的影响。以改良MS最好,愈伤组织诱导率为85%,出愈伤多,质量高。消毒时间和接种方式对愈伤组织诱导率亦有显著影响。初展开叶片消毒8~10 min,背面向下接入培养基,愈伤组织诱导率高。外源激素对愈伤组织的诱导,增殖和芽分化影响显著。单独使用BA不能诱导红掌叶片产生愈伤组织,高浓度BA、低浓度2,4.D时,愈伤组织诱导率高。在MS+BA0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+CM.5%培养基上,芽分化率为97.5%,平均芽分化数为4.5个/块,芽粗壮。将分化出的芽转入1/2 MS+NAA 0.2 mg/L+AC 1 g/L培养基上诱导生根,生根率达100%,根健壮。
2.头孢霉素和羧苄青霉素对红掌愈伤组织增殖和芽分化具有抑制作用,浓度越高,抑制作用增强,同一浓度下,头孢霉素对红掌愈伤组织增殖和芽分化的抑制作用比羧苄青霉素强。头孢霉素和羧苄青霉素均可以抑制农杆菌的增殖,羧苄青霉素的抑制作用强于头孢霉素,羧苄青霉素浓度为250 mg/L时,基本上可抑制农杆菌的生长(OD<,600>=0.08)。头孢霉素浓度为350 mg/L时,可以完全抑制农杆菌的生长。因此,在遗传转化过程中,采用300 mg/L的羧苄青霉素进行脱菌培养,且随着继代次数的增加浓度逐渐降低。
3.50 mg/L潮霉素基本上可抑制红掌愈伤组织增殖和芽分化,25 mg/L潮霉素抑制未转化苗生根。因此,在红掌遗传转化中,愈伤组织和生根阶段潮霉素的筛选浓度分别为50 mg/L和25 mg/L。
4.研究了AS、菌液浓度、侵染时间、预培养时间、共培养时间等因素对转化效率的影响。结果表明,AS是农杆菌介导红掌遗传转化所必需的,添加AS后瞬时表达率显著提高。菌液浓度、侵染时间、预培养时间、共培养时间对转化的效果有显著影响。红掌最佳转化程序为:愈伤组织预培养2 d,菌液和共培养中添加100μmol·L<-1>AS,菌液OD<,600>值0.4,侵染时间20min,共培养3 d,在上述转化程序下,Gus基因瞬时表达率17.5%,PCR实验结果表明,Gus基因已整合到红掌基因组中。
通过上述研究,建立了红掌遗传转化受体系统和转化体系,为今后利用转基因方法改良红掌品种奠定了坚实基础。