论文部分内容阅读
第一章PERK/eIF2a通路介导氧化型低密度脂蛋白诱导的内皮细胞凋亡及其机制研究目的探讨PERK/eIF2a通路在氧化型低密度脂蛋白诱导的内皮细胞凋亡中的作用及其机制。方法(1)研究ox-LDL对内皮细胞PERK蛋白表达及eIF2a蛋白磷酸化的影响。培养细胞分为8组：其中4组是在培养液中不加入任何干预因素,内皮细胞分别培养0,12,24,48小时；另有组在培养液中加入ox-LDL(100μg/ml),内皮细胞分别培养0,12,24,48小时。采用western-blot法检测细胞内PERK蛋白表达及eIF2a蛋白磷酸化。(2)研究PERK基因沉默后对ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡、caspase-3、CHOP的影响。分为6组：空白对照组：不加任何干预因素,孵育内皮细胞24h；非靶点sh RNA组或PERK sh RNA组：分别转染非靶点sh RNA或PERK sh RNA入内皮细胞后,孵育内皮细胞24h; ox-LDL组：ox-LDL(100μg/ml)(?)育内皮细胞24小时；Ox-LDL+非靶点sh RNA组或Ox-LDL+PERK sh RNA组：在成功转染非靶点sh RNA或PERK sh RNA入内皮细胞后,用ox-LDL (100μg/ml)继续孵育内皮细胞24小时。内皮细胞凋亡率检测采用流式细胞仪；内皮细胞内的caspase-3活性测定采用比色法；CHOP mRNA水平采用Real-time PCR法检测。(3)研究特异性eIF2a磷酸化抑制剂Salubrinal对ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡、caspase-3、CHOP的影响。分为4组：空白对照组：不加任何干预因素,孵育内皮细胞24h; ox-LDL组：ox-LDL (100μ/ml)孵育内皮细胞24小时；+salubrinal或单纯salubrinal组：40μM的salubrinal预处理内皮细胞1h后,分别用含100μg/ml ox-LDL的DMEM培养液或用含1%小牛血清的DMEM培养液继续孵育内皮细胞24小时。内皮细胞凋亡率检测采用流式细胞仪；内皮细胞内的caspase-3活性测定采用比色法；CHOP mRNA水平采用Real-time PCR法检测。(4)研究PERK基因沉默后对ox-LDL诱导的内皮细胞eIF2a蛋白磷酸化的影响。分为4组：空白对照组：不加任何干预因素,孵育内皮细胞24h; ox-LDL组：ox-LDL (100μg/ml)孵育内皮细胞24小时；Ox-LDL+PERK sh RNA组：在成功转染PERK sh RNA入内皮细胞后,用ox-LDL(100μg/ml)继续孵育内皮细胞24小时；+salubrinal组:40μM的salubrinal预处理内皮细胞1h后,用含100μg/ml ox-LDL的DMEM培养液继续孵育内皮细胞24小时。结果(1) ox-LDL呈时间依赖性的增加内皮细胞PERK蛋白表达及eIF2a的磷酸化(P<0.05,P<0.01)。(2)与对照组相比,ox-LDL (100μg/ml)培养内皮细胞24小时显著增加内皮细胞凋亡率(P<0.01),增强内皮细胞caspase-3活性,升高内皮细胞CHOP mRNA水平,PERK基因沉默或给予特异性eIF2a磷酸化抑制剂Salubrinal后可抑制上述过程。(3)与对照组相比,ox-LDL促进内皮细胞eIF2a蛋白磷酸化,PERK基因沉默后或加入特异性eIF2a磷酸化抑制剂Salubrinal后,可显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞eIF2a蛋白的磷酸化。结论：(1) ox-LDL可触发内皮细胞内质网应激。(2) ox-LDL诱导内皮细胞凋亡,其机制与激活PERK/eIF2aCHOP/caspase-3通路有关。第二章辛伐他汀抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的内质网应激及内皮细胞凋亡目的：探讨辛伐他汀抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的内皮细胞凋亡及其与PERK/eIF2a通路的关系。方法(1)研究辛伐他汀对ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡、CHOP mRNA、caspase-3活性的影响。培养细胞分为7组：空白对照组：用含1%小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时；ox-LDL组：用含100. μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时；ox-LDL+辛伐他汀(0.μM)组：加入终浓度为0.1μM的辛伐他汀孵育细胞1小时后,加入100μg/ml ox-LDL继续孵育24小时；ox-LDL+辛伐他汀(0.5μM)组：加入终浓度为0.5μM的辛伐他汀孵育细胞1小时后,加入100μg/ml ox-LDL继续孵育24小时；ox-LDL+辛伐他汀(2.5μM)组：加入终浓度为2.5μM的辛伐他汀孵育细胞1小时后,加入100μg/ml ox-LDL继续孵育24小时；+salubrinal组：加入终浓度为40pM的salubrinal(特异性eIF2a磷酸化抑制剂)孵育细胞1小时后,加入100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时；+DEVD-CHO组：加入终浓度为100μM的DEVD-CHO(特异性caspase-3抑制剂)孵育细胞1小时后,加入100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时；采用流式细胞仪检测内皮细胞凋亡率,采用Real-time PCR法检测CHOP mRNA的表达,采用比色法检测内皮细胞内caspase-3活性。(2)研究辛伐他汀对ox-LDL诱导的内皮细胞PERK蛋白表达及eIF2a蛋白磷酸化的影响。培养细胞分为6组：空白对照组：用含1%小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时；ox-LDL组：用含100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时；ox-LDL+辛伐他汀(0.1组：加入终浓度为0.1的辛伐他汀孵育细胞1小时后,加入100μg/ml ox-LDL继续孵育24小时；ox-LDL+辛伐他汀(0.5μM)组：加入终浓度为0.5μM的辛伐他汀孵育细胞1h后,加入100μg/ml ox-LDL继续孵育24h; ox-LDL+辛伐他汀(2.5μM)组：加入终浓度为2.5μM的辛伐他汀孵育细胞1小时后,加入100μg/ml ox-LDL继续孵育24小时；+salubrinal组：加入终浓度为40μM的salubrinal (特异性eIF2a磷酸化抑制剂)孵育细胞1h后,加入100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时；采用western-blot法检测细胞内PERK蛋白表达及eIF2α蛋白的磷酸化。结果(1)与对照组相比,ox-LDL (100μg/ml)培养内皮细胞24小时显著增加内皮细胞凋亡率(P<0.01),辛伐他汀(0.1μM,0.5μM和2.5μM)呈浓度依赖性的抑制ox-LDL诱导的内皮细胞的凋亡(P<0.05或P<0.01)。特异性eIF2a磷酸化抑制剂Salubrinal (40μM)或特异性的caspase-3阻断剂DEVD-CHO (100μM)可显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞的凋亡率(P<0.01),增强内皮细胞caspase-3活性,升高内皮细胞CHOP mRNA水平,PERK基因沉默或给予特异性eIF2a磷酸化抑制剂Salubrinal后可抑制上述过程。(2)与对照组相比,ox-LDL (100μg/ml)培养内皮细胞24小时显著增加内皮细胞PERK蛋白表达及eIF2a蛋白磷酸化,辛伐他汀(0.1μM,0.5μM和2.5μM)呈浓度依赖性的抑制ox-LDL诱导的PERK蛋白表达及eIF2a蛋白磷酸化(P<0.05或P<0.01)。特异性eIF2a磷酸化抑制剂Salubrinal (40μM)可显著抑制ox-LDL诱导的eIF2a蛋白磷酸化(P<0.01),但对PERK蛋白表达没有影响。结论：辛伐他汀抑制ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡,其机制与抑制PERK/eIF2aCHOP/caspase-3通路有关。