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软骨细胞的有丝分裂活动极低、修复能力差。软骨细胞体外培养时其有限增殖性、对接种密度的依赖性及其难以持续保持其细胞表型是软骨组织工程的难题，体外获得大量保持细胞表型的软骨细胞是进行软骨组织工程和建立软骨细胞库的先决条件。 在无蛋白琼脂糖培养基中，软骨细胞接种密度＞10~5cells／cm~2时能存活数周；密度＜10~5cells／cm~2时，绝大多数细胞几天内即发生死亡，说明软骨细胞只有接收到邻近细胞释放的活性细胞因子后才能存活。Edward研究表明体外单层培养的软骨细胞经7-8次传代后可丧失分泌Ⅱ型胶原和氨基多糖(PG)能力，而某些细胞活性因子，如BMP、FGF、IGF等对提高软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和氨基多糖起着关键性的作用，因此提高软骨细胞自身分泌细胞活性因子的能力是形成稳定、成熟软骨细胞的关键。BMP3体内外实验均证实可明显地促进多种来源软骨细胞的增殖，并且有利于软骨细胞保持其表型。Frank用胰蛋白酶消化牛BMP3后测序发现牛与人BMP3有许多同源性，所不同的是人BMP3(hBMP3)只诱导软骨细胞的形成，使后者分泌Ⅱ型胶原和氨基多糖增多。Carrington也证实BMP3可明显促进鸡肢芽软骨细胞的分裂增殖。 本课题通过基因克隆将hBMP3的cDNA构建在真核表达载体PcDNA3上，形成重组真核表达载体PcDNA3-hBMP3；在脂质体介导下，利用细胞培养和基因转染技术体外转染兔关节软骨细胞；后通过核酸杂交和蛋白电泳技术检测转染后细胞hBMP3的表达情况，并分析hBMP3基因转染对软骨细胞增殖的影响。用转基因的方法提高软骨细胞内源性细胞因子的表达，形成内源性细胞促进生长机制，是解决软骨细胞培养困难、表型易变的新途径、新思维，也为体外软骨组织工程和关节软骨病的基因治疗提供了直接的实验依据。 第一部分 培养状态下兔关节软骨细胞生长特性的观察 兔关节软骨细胞的消化分离、体外培养和冻存，即建立转染的靶细胞系是进行重组PcDNA3-hBMP3基因转染的先决条件。通过对软骨细胞生长特性的观察，为以后软骨细胞基因转染提供必要的实验条件。 选用出生28天的新西兰兔一只，取其肱骨、胫骨和股骨远端的关节软骨，在软骨细胞消化小室内，利用0.05％睾丸透明质酸酶、0.2％胰蛋白酶和0.2％Ⅱ型梭壮芽孢杆菌胶原酶消化、分离软骨细胞原代。通过记数板计数统计消化分离软骨细胞的总量，加入DMEM培养液稀释至10~5cells／ml，形成细胞的混悬液，