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(R,R)-2,3-丁二醇是一种重要的大宗平台化合物,有广泛的应用价值和前景。生物发酵法合成(R,R)-2,3-丁二醇因其原料可再生、反应友好的优势而引起广大科研人员的关注与研究。前期的研究主要是从环境中筛选高产(R,R)-2,3-丁二醇的菌株,随着合成生物学技术的发展,以代谢工程和基因工程的技术手段为支撑,构建高产(R,R)-2,3-丁二醇微生物细胞工厂是一种行之有效的途径。本研究以大肠杆菌(Escherichia coli MG1655)作为底盘细胞,对细胞主代谢途径、副产物合成途径进行系统分析,利用代谢工程策略对关键代谢节点进行合理的遗传改造,使用合成生物学策略设计和构建(R,R)-2,3-丁二醇的人工合成途径并导入底盘细胞获得高产光学纯(R,R)-2,3-丁二醇的微生物细胞工厂,并进行发酵参数和补料工艺优化。主要内容和研究结果如下:(1)对合成副产物相关的一些关键酶基因(丁二酮还原酶基因dar、富马酸还原酶基因frd ABCD、丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl B、乙醇脱氢酶基因adh E、乳酸脱氢酶基因ldh A、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因pps和磷酸乙酰转移酶基因pta)进行敲除改造,分别导入课题组前期合成的携带合成(R,R)-2,3-丁二醇的三个关键酶基因(α-乙酰乳酸合成酶基因bud B、α-乙酰乳酸脱羧酶基因bud A和(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh的质粒p Trc99A-bud Bbud A-bdh构建系列细胞工厂。在摇瓶(50 m L/250 m L)发酵水平和1 L发酵罐水平(0.5 L/1 L)进行发酵,筛选得到合成(R,R)-2,3-丁二醇产量较高的细胞工厂GXASY8 bdh,其在发酵罐上以初始100 g/L葡萄糖分批发酵24h,得到(R,R)-2,3-丁二醇的产量为24.60 g/L,得率0.25 g/g底物,光学纯度97.68%,(R,R)-2,3-丁二醇的产量比改造前提高了34.21%,副产物乙酸、甲酸以及乳酸的浓度分别降低了83.77%,69.13%和66.30%,未检出丁二酸和乙醇。(2)在1 L发酵罐水平(0.5 L/1 L),以木薯粉酶解液作为底物发酵得到22.02 g/L的(R,R)-2,3-丁二醇,仅略低于葡萄糖作为底物的发酵;随着底物浓度的增加,(R,R)-2,3-丁二醇的浓度也逐渐增加。优化后的发酵条件:温度为37℃、通气量为0.5 L/min,采用两阶段控制p H值,初始为7.0,下降至6.5时,保持恒定p H 6.5至发酵结束。(R,R)-2,3-丁二醇的产量为28.26g/L,生产强度1.4 g/(L·h),得率0.29 g/g底物,(R,R)-2,3-丁二醇的产量相比优化前提高了28.34%。(3)在3 L发酵罐水平(1.5 L/3 L),发酵条件:温度为37℃、通气量为1.5 L/min,p H 6.5,当发酵进行至底物浓度在30-40 g/L之间时补充木薯粉-棉籽粉酶解液至底物浓度为130 g/L,通过氨水调节p H值维持6.5,发酵52 h得到(R,R)-2,3-丁二醇产量达108.80 g/L,比摇瓶发酵(24.6 g/L)提高了342.28%,比分批发酵(28.26 g/L)提高了285%,比单纯补充木薯粉酶解液的分批补料发酵(94.93 g/L)提高了14.61%,生产强度为2.09g/(L·h),得率为0.53 g/g底物。本研究构建细胞工厂,优化以木薯粉为原料的发酵过程,实现较高的(R,R)-2,3-丁二醇产量,为发展木薯转化生物基化学品提供了新知识。