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背景: 肝性脑病(Hepatic Encephalopathy,HE)是一种广谱的神经异常综合征,早期主要通过特定的神经心理检测诊断,主要是由肝功的损害或门体分流所诱导。事实上,临床中约有40%的肝硬化患者会发展成为HE,随后发生死亡。临床中肝性脑病患者伴随运动功能减退、行为障碍或活动减少,严重的影响着HE患者的生活状态,但是目前对HE的发病和运动障碍的机制仍然不清楚。近年研究发现HE的发生发展中氧化应激(Oxidative Stress,OS)扮演着重要的角色,并且发现在其它的神经疾病如帕金森(Parkinson’s Disease,PD)、阿尔兹海默病(Alzheimers’s Disease,AD)中通过过表达解偶联蛋白-2(Uncoupling Protein 2,)降低OS可以起到重要的神经保护作用,进而起到保护神经和促进运动的功能。但是在HE的黑质网状部(Substantia Nigra reticular part,SNr)中UCP2的表达变化,以及UCP2对HE有何影响目前并无相关研究。因此,本文通过观察HE小鼠SNr内UCP2的表达变化,并通过靶向干扰或者过表达调控SNr内的UCP2,观察UCP2对肝性脑病运动迟缓的作用,并提供可能的机制。 目的: 1. 观察硫代乙酰胺(Thioacetamide,TAA)诱导的HE小鼠黑质(Substantia Nigra, SN)中线粒体形态的表达变化。(论文1) 2. 观察HE小鼠SN内UCP2在不同时间内的表达差异;观察HE小鼠运动情况,并经脑定位注射给予UCP2过表达或干扰的AAV病毒,进一步观察肝性脑病小鼠运动的变化;探讨 UCP2 对肝性脑病小鼠运动障碍改善的可能的机制,为今后临床治疗肝性脑病运动迟缓患者提供可能的靶点,研制新药的方向和理论的基础。(论文2) 方法: 通过腹腔连续注射TAA 300 mg/kg 三天,制备肝性脑病模型。肝性脑病模型制备成功后分别在1 d、4 d、7 d取肝组织和血液,进行H&E染色、肝功(ALT、AST)以及血氨水平的检测;之后使用脑模具分离黑质,并分别提取总蛋白和线粒体蛋白检测线粒体分裂蛋白DRP1以及自噬蛋白PINK1和PARKIN的表达变化;最后在电镜下直接观察肝性脑病黑质中线粒体形态学的表达变化(论文1); 接下来,通过脑定位注射方法将UCP2空AAV病毒(过表达或者干扰)注射入小鼠双侧SNr内,病毒表达第14 d后则腹腔注射TAA制备肝性脑病模型,4 d后运用转棒、旷场以及高架十字试验检测其行为学变化后取材;利用免疫荧光、Western Blot 和RT-qPCR观察病毒注射部位UCP2的表达量和病毒的特异性;利用Elisa检测SNr内的氧化应激和ATP水平;接下来观察UCP2在肝性脑病小鼠SNr内与GABA神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞之间的关系;然后进一步观察在 SNr 内调控UCP2对血氨和肝脏损伤的影响;最后进一步利用Western Blot 和RT-qPCR方法检测肝性脑病SNr内调节UCP2对KCC2的表达变化。(论文2) 结果: 首先,TAA 腹腔注射成功诱导小鼠急性肝衰竭,并伴血氨水平的升高,意味着肝性脑病模型构建成功;肝性脑病小鼠黑质中线粒体动力学发生明显变化,表现为:在黑质线粒体中分裂蛋白DRP1表达水平增加;同时伴有线粒体自噬蛋白PINK1和PARKIN 表达水平也升高;电镜结果进一步证实肝性脑病黑质中线粒体形态学发生显著变化,即线粒体数量增加,但总面积降低。(论文1) 接下来在SNr中靶向干预UCP2,观察UCP2对HE小鼠运动的影响。首先发现在HE小鼠SNr中UCP2在蛋白和mRNA水平表达均升高,而UCP4却无显著变化;接下来分别用转棒、旷场、高架行为学检测发现肝性脑病时伴随着平衡能力和运动功能的障碍;以及SNr内抗氧化酶系统(GSH、SOD)消耗增加,而ATP水平降低;接下来利用脑定位方法注射UCP2空病毒(过表达或者干扰)于SNr中,免疫荧光结果提示病毒注射位置、表达效果和特异性均较佳,在蛋白和mRNA水平也得到了相同的验证;行为学结果显示上调SNr中UCP2可明显改善肝性脑病小鼠运动和平衡功能障碍,而下调SNr中UCP2可加重肝性脑病小鼠运动和平衡功能障碍;为了探明可能的机制,我们检测UCP2对SNr内的氧化应激和ATP表达的影响。发现过表达UCP2则会降低SNr内的氧化应激水平从而恢复部分的抗氧化酶,并增加SNr 内的ATP水平,而干扰UCP2则与之相反;我们利用免疫荧光双标的方法发现UCP2主要表达在GABA能神经元中,而非胶质细胞(GFAP,IBA-1)中;为了进一步说明UCP2对GABA能神经元有何影响,我们观察了KCC2蛋白表达水平,发现UCP2可明显恢复SNr内KCC2的表达。(论文2) 结论: 1.线粒体分裂和自噬诱导的形态改变可能参与肝性脑病黑质中的神经病理学的改变。(论文1) 2.肝性脑病小鼠黑质网状部内增加 UCP2,可以降低 GABA 能神经元内的氧化应激水平并恢复KCC2的表达,从而恢复SNr内GABA能神经元的功能,进一步改善HE小鼠的运动功能。本研究阐明了肝性脑病小鼠运动障碍的可能的新机制,为临床HE患者提供可能的治疗靶点和新药物的研发。(论文2)