苎麻雄性不育相关atp9基因RNAi表达载体的构建、遗传转化及其分子进化研究

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苎麻(Boehmeria nivea(L.) Gaud.)为荨麻科(Urticaceae)、苎麻属(BoehmeriaJacq)植物,在我国栽培历史已有两千多年,是我国特有的天然优良纤维作物,也是纺织工业的重要原料之一,在国民经济中占重要地位。我国苎麻种植面积和产量占世界总量的90%以上,是一种重要的出口创汇作物。苎麻雄性不育特性早在20世纪60~70年代就被发现存在于若干地方品种之中,但有关的基础理论研究尚待深入。本文通过对苎麻雄性不育系GS14-1及其保持系GS13-X2花序发育进行形态学比较,鉴定雄性不育系GS14-1的败育特征;通过克隆苎麻atp6和atp9基因片段,构建苎麻atp6和atp9基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)表达载体,并将苎麻atp9基因RNAi表达载体转化苎麻和烟草,验证atp9基因在苎麻雄配子发生过中的作用。同时构建了拟南芥atp9基因RNAi表达载体并转化拟南芥。除了研究苎麻atp9基因在植物个体发育中的作用,为了明确该基因在植物系统发育中的特征和作用,我们还开展了陆生植物线粒体atp9和叶绿体atpH基因及其蛋白质序列分子进化方面的研究。主要研究结果如下:  (1)苎麻雄性不育系GS14-1主要败育的特征为:雄花序轴发育停滞,始终停留在花序发育的早期形态;雄花序轴很短、分枝轴很少;雄蕾不膨大,部分雄蕾具有发育停滞的透明雄蕊;雄蕾中没有成熟花粉粒,无法被I2-KI染色;雌花发育正常,能够杂交形成种子。  (2)苎麻和烟草组织培养高效再生体系的验证表明:所用苎麻品种湘苎三号在适宜的激素诱导下具有10%-30%的不定芽再生频率,每个外植体愈伤组织可以长出1-2个芽;所用烟草受体品种SR-1具有100%不定芽再生频率,每个外植体可以长出8-10个芽;经酶切鉴定确认完成了苎麻atp6和atp9基因RNAi表达载体的构建;苎麻atp9基因RNAi表达载体转化苎麻后,由于外植体与农杆菌侵染后褐化未能得到转化苗;将苎麻atp9基因RNAi表达载体转化烟草后,花粉育性降低了50.97%,造成了烟草雄性不育。  (3)经酶切鉴定完成了拟南芥atp9基因RNAi表达载体的构建,转化拟南芥后,初步结果发现转化植株花粉形态比野生型较为短圆,花葶较短,角果数目较少,表明其结实率有所下降。  (4)通过基因序列比对,发现拟南芥、水稻都具有与线粒体atp9基因序列完全相同的核拷贝基因,分别位于拟南芥第2染色体和水稻第12染色体。  (5)通过蛋白序列比对,发现同为ATP合成酶c亚基的线粒体ATP9蛋白和叶绿体atpH蛋白具有高度保守的功能结构区,其丙氨酸、甘氨酸和亮氨酸三种氨基酸含量的总和占了全部氨基酸含量的一半左右。分子进化研究结果表明线粒体ATP9和叶绿体atpH两者各自具有不同的起源。  (6)对植物线粒体atp9和叶绿体atpH基因的核酸分子进化速率分析结果表明,苎麻、匍匐筋骨草等植物线粒体atp9基因具有较快的同义替换速率;线粒体atp9核酸替换速率具有明显的不均一性,叶绿体atpH核酸替换速率较为均一;线粒体atp9和叶绿体atpH的同义替换速率都高于非同义替换速率。
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