第一部分 自然衰老大鼠胸主动脉细胞骨架的改变及益气活血中药的干预作用目的：观察人参三七川芎提取物对自然衰老大鼠胸主动脉及骨架蛋白的影响。方法：以自然衰老大鼠胸主动脉作为研究对象,21月龄大鼠作为衰老模型,实验分为模型组、中药低、中、高剂量组及白藜芦醇组,各给药组分别从18月龄开始药物干预,连续灌胃3个月,给药浓度分别为中药低(0.58g/kg)、中(1.16g/kg)、高(2.32g/kg)剂量组及白藜芦醇组(50mg/kg),模型组给予同体积的纯净水,同时以3月龄SD人鼠作为青年组。应用HE染色观察血管形态的改变,β-半乳糖苷酶特异染色法计算蓝染组织比率,免疫荧光染色观察骨架蛋白F-actin形态的改变,Western blot检测F-actin和SM22α蛋白的表达情况。结果：与青年组相比,模型组血管内膜损伤且不光滑,中膜明显增生且排列紊乱,弹力板扭曲、断裂、结构不完整,外膜增生明显,SA-β-gal染色组织蓝染比率明显增加,F-actin荧光强度及蛋白表达明显增多,而SM22α蛋白表达明显减少；药物干预后,血管壁内皮受损不显,中膜增厚不明显,弹力膜结构较完整,SA-β-gal染色组织蓝染比率明显降低,同时可以减少F-actin荧光强度及蛋白表达量并增加SM22α的蛋白表达。结论：细胞骨架微丝蛋白F-actin形态及蛋白表达在衰老过程中改变明显,其相关蛋白SM22α蛋白表达亦改变明显,其可能共同参与了血管老化的进程；人参三七川芎提取物可以一定程度上延缓血管老化,且对于血管F-actin和SM22a蛋白有明显干预作用,其可能通过此作用延缓了血管老化的进程。第二部分 复制性衰老血管平滑肌细胞骨架蛋白的改变及益气活血中药的干预作用目的：观察人参三七川芎提取物对复制性衰老血管平滑肌细胞及其骨架蛋白F-actin和SM22α的影响。方法：以人主动脉平滑肌细胞作为研究对象,复制性衰老9代细胞作为衰老模型,实验分为青年组(5代细胞)、模型组(9代细胞)、中药低(100mg/L)、中(200mg/L)、高(400mg/L)剂量组及白藜芦醇组(10umol/L),药物干预时间为48小时。采用p-半乳糖苷酶特异染色法计算蓝染细胞比率,CCK-8检测细胞增殖能力,流式细胞技术分析细胞周期,免疫荧光染色观察细胞F-actin、G-actin和SM22α形态的改变,Western blot检测F-actin和SM22α的蛋白表达情况。结果：与青年组相比,模型组细胞体积增大,形态不规则,G0/G1期数量增多,S期数量减少,CCK-8检测细胞增殖能力减弱,且β-半乳糖苷酶染色蓝染数量增多,符合衰老模型特点,且F-actin部分呈纵向平行排列,形成大量应力纤维,蛋白表达升高；G-actin在细胞中央区域染色变弱,向周边区域不规则扩展,部分出现边缘变模糊、空洞或呈败絮状；SM22α染色模糊暗淡,边缘不显,荧光强度明显减弱,蛋白表达下降。药物干预后,可以有效的降低p-半乳糖苷酶染色蓝染细胞数量,减少G0／G1期的细胞数量,同时增加S期的细胞数量,减少F-actin蛋白的表达量及应力纤维的形成,增强SM22α荧光染色强度及蛋白表达量,并具有统计学意义。结论：复制性衰老的血管平滑肌细胞可以作为衰老研究的模型；骨架蛋白F-actin和SM22α的形态和蛋白表达在细胞衰老过程中改变明显,其可能一同参与了平滑肌细胞衰老的进程；人参三七川芎提取物一定程度上延缓了血管平滑肌细胞的老化,且对于F-actin和SM22α有明显干预作用,并可能通过此作用延缓了血管老化的进程。第三部分益气活血中药对复制性衰老平滑肌细胞骨架蛋白作用机制探讨目的：探讨人参三七川芎提取物对复制性衰老血管平滑肌细胞骨架蛋白的作用机制。方法：以人主动脉平滑肌细胞作为研究对象,利用基因转染技术,建立HSP27基因敲低的衰老模型,实验分为基因未敲低衰老组、基因未敲低中药组(200mg/L)、基因未敲低白藜芦醇组(10umol/L)、基因敲低衰老组、基因敲低中药组(200mg/L)及基因敲低白藜芦醇组(10umol/L),药物干预时间为48小时。采用p-半乳糖苷酶特异染色法计算蓝染细胞比率,免疫荧光染色观察细胞F-actin和SM22α形态的改变,Western blot检测F-actin和SM22α的蛋白表达情况。结果：与HSP27基因未敲低衰老组相比,HSP27基因敲低衰老组SA-β-gal染色蓝染细胞数量增多,F-actin和SM22Kα荧光强度及蛋白表达明显减少,差异均具有统计学意义；而基因敲低各组之差异无统计学意义。结论：将平滑肌细胞HSP27基因敲低后,SA-β-gal染色蓝染细胞数量增多,表明细胞老化程度加深；平滑肌细胞HSP27基因敲低后,磷酸化的HSP27随之下降,骨架蛋白F-actin及相关蛋白SM22a表达量下降,明确了HSP27基因对细胞骨架的调节作用,并可能通过此作用参与了调节血管老化的过程；HSP27基因敲低各组药物干预作用不如未敲低各组明显,考虑人参三七川芎提取物作用靶点有可能与HSP27／磷酸化HSP27/F-actin通路有关。第四部分益气活血中药对诱导自噬的血管平滑肌细胞的干预作用目的：观察人参三七川芎提取物对复制性衰老及饥饿诱导白噬发生的血管平滑肌细胞的干预作用。方法：本研究以复制性衰老的平滑肌细胞为研究对象,实验分为四组,分别为青年组、衰老模型组、中药组(200mg/L)、白藜芦醇组(10umol/L),药物干预时间为48小时,利用Western blot检测自噬相关蛋白Beclinl与LC3-1I的表达；并利用饥饿诱导自噬的发生,建立了饥饿2小时而发生自噬的血管平滑肌细胞模型,实验分为四组,分别为正常组、饥饿2h模型组、中药组(200mg/L)、白藜芦醇组(10umol/L),药物干预时间为48小时,利用透射电子显微镜观察自噬体的形成,用Western blot检测自噬相关蛋白Beclin1与LC3-II的表达。结果：与青年组相比,衰老模型组的Beclin1与LC3-1I蛋白表达明显减少,具有显著差异性(P<0.01)；与衰老模型组相比,中药及白藜芦醇组Beclin1及LC3-II蛋白表达增多,具有统计学意义(P<0.05)；与正常组相比,饥饿模型组的细胞不规则变形,细胞膜损伤,染色质呈颗粒状,胞质内出现大量双层膜结构的自噬体及自噬空泡,次级溶酶体增多,Beclin1与LC3-II蛋白表达明显增多,具有显著差异性(P<0.01)；与饥饿模型组相比,中药及白藜芦醇组细胞形态规则,核膜相对光滑完整,胞质中产生大量的自噬体、自噬空泡及次级溶酶体,Beclinl及LC3-II蛋白表达增多,具有显著差异性(P<0.01)。结论：复制性衰老的平滑肌细胞自噬水平降低；人参三七川芎提取物可以提高饥饿诱导自噬发生的细胞的自噬水平；人参三七川芎提取物有可能通过提高自噬水平从而发挥延缓血管老化的作用。