论文部分内容阅读
背景前列腺癌是泌尿外科较为常见的一种恶性肿瘤。全球癌症发病率及致死率情况统计中,前列腺癌占全球癌症总发病率的7.8%;而在致死率方面,前列腺癌的癌症相关死亡率也仅次于肺癌、乳腺腺癌及结直肠癌。在我国,随着寿命的延长、健康意识的提高及前列腺癌早期诊断方法的不断进步,前列腺癌新发病例呈逐年增加趋势,据预测,未来相当长的一段时期内可能还会存在一个较大程度的増长。前列腺癌的早期诊断和治疗对疾病的预后具有重要意义。随着医疗技术的提高,目前多种方法可在早期发现前列腺癌。但即便如此,仍有较大比例的患者在发现时已发生骨转移。骨骼是前列腺癌的首要转移靶器官。发生骨转移的前列腺癌患者治疗难度加大,且患者常出现周身骨骼疼痛、骨折、瘫痪等,严重影响前列腺癌患者的生活质量。目前前列腺癌骨转移的发生原因并不清楚。明确骨转移的发生机制对延长患者的生存期及改善生活质量具有重要意义。研究目的1筛选、鉴定与前列腺癌发生及骨转移相关的差异性表达蛋白;2检测筛选得到的差异蛋白PHD3及Desmin在前列腺癌中的表达及相关性;3探究PHD3对Desmin的调控在前列腺癌骨转移过程中的作用及分子机制,为前列腺癌的治疗提供新的靶点。研究方法1前列腺癌发生及骨转移相关差异性表达蛋白的筛选与鉴定1.1 SELDI-TOF-MS筛选前列腺癌发生及骨转移相关差异性表达蛋白应用SELDI-TOF-MS技术测定前列腺癌癌旁组(癌旁组)、前列腺癌无骨转移组(无骨转移组)及前列腺癌骨转移组(骨转移组)组织标本的差异性表达蛋白的m/z值。1.2前列腺癌发生及骨转移相关差异性表达蛋白的分离与鉴定应用TRICINE-聚丙烯酰胺凝胶电泳(TRICINE-SDS-PAGE)、MALDI-TOF/TOF-MS技术分离纯化、鉴定前列腺癌骨转移相关差异性表达蛋白。2 PHD3及Desmin在前列腺癌中的表达及二者的相关性分析2.1免疫组织化学检测组织标本中PHD3及Desmin的表达水平并分析二者相关性使用免疫组织化学技术观察PHD3及Desmin在癌旁组、无骨转移组及骨转移组组织标本中的表达情况。统计学方法分析PHD3与Desmin二者表达的相关性。2.2免疫印记分析组织标本中PHD3及Desmin的蛋白表达水平提取各组标本的总蛋白,Western blot法检测PHD3及Desmin在不同组组织中的表达水平。2.3实时荧光定量PCR技术检测组织标本中PHD3及Desmin的m RNA水平以癌旁组织为对照,应用实时荧光定量PCR技术检测不同组的前列腺癌肿瘤组织中PHD3及Desmin的m RNA水平。3 PHD3及Desmin在前列腺癌骨转移中的作用及分子机制3.1 PHD3对Desmin m RNA及蛋白表达水平的影响使用sh RNA干扰PHD3蛋白表达,Western blot及q RT-PCR检测Desmin m RNA及蛋白表达水平。使用过表达质粒转染LNCa P细胞后,再次使用上述方法检测Desmin m RNA及蛋白表达水平。免疫荧光观察Desmin表达定位及多少变化。明确PHD3对Desmin表达的调控作用。3.2 PHD3可通过结合于NEDD4蛋白从而抑制NEDD4与Desmin的结合使用免疫共沉淀的方法检测PHD3与NEDD4是否能够结合。使用sh RNA干扰PHD3表达后观察NEDD4蛋白表达是否受影响。并通过免疫共沉淀的方法检测PHD3对NEDD4与Desmin的结合是否存在影响。明确PHD3、NEDD4及Desmin三者的相互结合及影响。3.3裸鼠成瘤实验验证过表达Desmin对PHD3缺失的LNCa P增殖及转移的影响细胞分组:正常培养LNCa P组,sh RNA干扰PHD3组,sh RNA干扰PHD3+过表达Desmin组。检测各组PHD3及Desmin的蛋白表达水平。通过裸鼠成瘤实验明确PHD3及Desmin对肿瘤细胞转移及侵袭能力的影响。结果1前列腺癌骨转移相关差异性表达蛋白的筛选与鉴定1.1 SELDI-TOF-MS筛选前列腺癌骨转移相关差异性表达蛋白应用SELDI-TOF-MS技术筛选癌旁组、无骨转移组及骨转移组标本的差异性表达蛋白,结果显示其差异性表达蛋白的m/z位于8452Da及13367Da。1.2前列腺癌发生及转移相关差异性表达蛋白的分离与鉴定应用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离纯化目标蛋白,并将检测出的m/z位于8452Da及13367Da的肽段/蛋白质样品分别酶解及检测肽段。通过将肽段导入SEQUEST检索程序并在Bioworks数据库检索,m/z位于8452Da及13367Da的肽段/蛋白质分别为脯氨酸羟化酶3(prolyl hydroxylase 3,PHD3)与结蛋白(Desmin)。2 PHD3及Desmin在前列腺癌中的表达及相关性2.1免疫组织化学检测组织标本中PHD3及Desmin的蛋白表达水平及二者相关性免疫组织化学的方法发现在前列腺癌肿瘤组织中的PHD3及Desmin的表达水平明显低于癌旁组织中PHD3及Desmin的表达水平,且发生骨转移的患者前列腺癌组织中的PHD3及Desmin的表达水平更低。统计学方法分析发现PHD3及Desmin蛋白表达呈正相关。2.2免疫印记分析组织标本中PHD3及Desmin的蛋白表达水平应用免疫印记分析实验对上述筛选出的蛋白进行验证,结果显示在癌旁组、无骨转移组及骨转移组中,组织PHD3、Desmin的蛋白表达均呈逐渐降低趋势。2.3实时荧光定量PCR技术检测组织标本中PHD3及Desmin的m RNA水平实时荧光定量PCR技术发现在前列腺癌肿瘤组织中的PHD3的表达水平明显低于癌旁组织中PHD3的表达水平,且发生骨转移的前列腺癌组织中PHD3表达水平更低。而Desmin的m RNA水平在各组中无明显变化。提示Desmin可能存在转录后水平的调控。3 PHD3及Desmin在前列腺癌骨转移中的作用及分子机制3.1 PHD3对Desmin蛋白及m RNA表达水平的影响使用sh RNA及过表达质粒对PHD3表达进行干预,q RT-PCR结果提示干预效率高,可用于后续实验。使用sh RNA干扰PHD3蛋白表达后,Desmin蛋白及m RNA表达水平均显著下降。使用PHD3过表达质粒转染LNCa P细胞后,Desmin蛋白表达量显著上调,但m RNA水平无明显变化。免疫荧光染色提示,过表达PHD3后Desmin表达升高。提示PHD3对Desmin存在转录后调控作用。3.2 PHD3可通过结合于NEDD4蛋白从而抑制NEDD4与Desmin的结合免疫共沉淀结果提示:PHD3与NEDD4可直接结合。干扰PHD3表达虽然对NEDD4蛋白水平并无显著影响,但其与Desmin的结合显著增加,而反应体系中加入纯化PHD3后,NEDD4与Desmin的结合受到抑制。提示PHD3不影响NEDD4表达,但通过与其结合,影响NEDD4对Desmin的调控作用。3.3裸鼠成瘤实验验证过表达Desmin对PHD3缺失的LNCa P增殖及转移的影响裸鼠成瘤实验结果提示,干扰PHD3可明显增加前列腺癌的肿瘤转移,但过表达Desmin可抑制PHD3缺失导致的肿瘤细胞转移及侵袭。结论1使用SELDI-TOF-MS技术筛选并分离鉴定出前列腺癌发生及骨转移相关蛋白PHD3及Desmin。2 PHD3及Desmin与人前列腺癌骨转移相关,二者在发生转移的肿瘤组织中表达显著下降并呈正相关性。3 PHD3通过与NEDD4结合,竞争性抑制NEDD4对Desmin的结合及降解作用。恢复PHD3及Desmin表达可能是抑制前列腺癌骨转移的治疗新靶点。创新性本研究通过蛋白质组学的方法筛选并鉴定出前列腺癌骨转移相关的差异表达蛋白PHD3及Desmin,发现二者在前列腺癌特别是发生骨转移的组织中表达下降,且呈正相关性。在机制上,PHD3可通过结合于NEDD4,竞争性抑制NEDD4对Desmin的结合及调控作用。动物实验进一步证实,PHD3表达降低可促进前列腺癌转移,恢复Desmin的表达则对前列腺癌的转移具有重要的抑制作用。PHD3调控的Desmin在前列腺癌骨转移中的作用尚未见文献报道。通过干预PHD3调控的Desmin通路可能为抑制前列腺癌的转移提供新的治疗靶点。