半夏是我国著名大宗中药材之一,以块茎入药,具有止咳化痰功效。最近研究表明,半夏还有抗肿瘤、抗生育、降血脂以及护肝等作用。半夏属中性偏湿植物,在芒种夏至时期,半夏的地上部分出现枯萎即“倒苗”的现象(STF)。研究表示遮荫可以缓解半夏的倒苗,但由于目前半夏遗传信息的匮乏,相关研究主要集中在遮荫方式及效果等方面,而在遮荫处理调控半夏生长的分子机制方面并尚未见报道。本研究调查了田间种植条件下遮荫处理对半夏生理生化、半夏倒苗率以及块茎产量的影响,开展半夏遮荫处理比较转录组测序分析,筛选了内参基因,挖掘影响半夏生长的关键功能基因进行表达分析和功能验证。本研究取得如下结果:1.遮荫对半夏生长的影响统计遮荫处理7周半夏的倒苗率,发现遮荫条件下半夏倒苗率约为60%,显著低于对照组的100%倒苗率。比较平均单株半夏的块茎重量,遮荫组半夏平均单株块茎重量约14 g,为对照组的2倍。进一步分析遮荫对半夏叶绿素参数的影响,发现遮荫处理可显著诱导叶绿素积累,促进叶绿素荧光参数,包括初始荧光、最大荧光和qP的提升,并显著抑制叶绿素a:b和NPQ值。比较保护酶的酶活力,发现在遮荫条件下超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)的酶活性无明显变化,而过氧化氢酶(CAT)的活性显著提升。表明,遮荫可能通过增强叶绿素荧光参数和光合作用来降低STF。2.遮荫处理下半夏内参基因的筛选与确定为了得到田间遮荫处理适合的半夏内参基因,选取了Pt18S、PtEF1α、PtGAPDH、Ptsec3a、Pttubulin、PtL8、PtAPRT和Ptactin等8个半夏的内参基因。利用RT-qPCR的方法进行上述基因在遮荫和高温条件下以及不同组织部位中的表达分析,计算其Ct值,并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper进行内参基因的稳定性分析。结果表明,Pt18S和PtL8在遮荫处理中表达稳定性较好,Pt18S和PtAPRT在高温处理中表达相对稳定,而在不同组织部位中表达较稳定的基因是Pt18S。因此,研究结果表明Pt18S为适合半夏的内参基因。3.遮荫处理调控半夏生长的关键基因的挖掘对大田半夏分别进行全光照和遮荫处理,通过结合二代转录组测序和三代全长测序,分析了在正常光照和遮荫环境下生长的半夏的转录组谱,共获得136163条非冗余转录本,其N50平均值为2578 bp。与光照组相比,遮荫处理20 d诱导6384个基因的差异表达。基因注释和功能分析揭示差异基因主要参与生长素信号转导、多糖和蔗糖代谢、类苯基丙烷合成、光合通路等信号通路。挑取相关通路的差异基因进行表达验证分析,获得16个差异表达的候选基因。与对照相比,遮荫处理5 d时PtPIF3、PtSOD、PtCAT、PtPOD、PtARF1、PtXET和PtRGP基因表达水平上调,PtHY5、PtCAB151、PtRUB、PtPIN1、PtARF19、PtSUS和PtCHS基因表达水平下调,而PtPIN6和PtGR基因表达水平无明显变化;遮荫处理20 d时,PtPIF3、PtSOD、PtCAT、PtPOD、PtARF1、PtXET、PtRGP、PtCAB151、PtRUB、PtPIN1、PtARF19、PtSUS、PtCHS、PtPIN6和PtGR基因均呈现上调表达水平,而PtHY5基因表达水平显著降低。4.遮荫处理调控半夏生长的关键基因的功能验证分析基于转录组数据,针对上述16个候选基因的相互作用模型做出假设,挑取预测途径中的2个基因(PtCAT和PtSUS)。分别扩增出PtCAT和PtSUS基因全长序列且构建其超表达载体。通过农杆菌浸花法转化拟南芥,并筛选获得转基因拟南芥纯系以及挑取目标基因高表达的转基因拟南芥株系进行基因功能鉴定。在经过43.5°C高温胁迫3.5 h后24°C培养7 d统计存活率。结果显示,PtCAT转基因株系存活率在60%左右,PtSUS转基因株系存活率高达80%,PtCAT和PtSUS转基因株系均显著高于野生型拟南芥存活率(40%)。因此,推测PtCAT和PtSUS基因正向调控拟南芥对高温胁迫的耐受性,可能在遮荫调控半夏生长起到重要作用。