背景脑梗死(cerebral infarction)又称缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke),是各种原因导致脑动脉血流中断,局部脑组织因为缺氧缺血发生坏死,而引起相应神经功能障碍。脑缺血发生后如果能及时在再灌注时间窗内恢复缺血半暗带区的血氧供应,可以为神经及突触再生提供营养,改善患者的神经功能。然而,随着缺血区血液供应的恢复,也可能加重组织损伤和功能障碍,即缺血再灌注损伤(Ischemic reperfusion,I/R)。研究表明,在脑缺血再灌注损伤后,可以启动内源性血管生成机制,建立侧枝循环,适应脑组织缺血缺氧损伤,甚至抵御损伤进一步加重,并促进神经元的恢复,所以,调控内源性血管生成,重建缺血区血管网络,对改善脑部供血和促进神经功能恢复至关重要。血管新生即新生的毛细血管从已存在的血管侧枝中出芽及再塑,是一个复杂的生理病理过程,包括以下几个连续的环节[1]:①EC上的生长因子受体被激活,活化的EC通透性增加,基底膜溶解;②EC增生、迁移并增殖萌芽;③官腔再塑,血管平滑肌细胞、星形胶质细胞等增殖、分化形成成熟的血管腔。EPC是可以直接分化为EC的前体细胞,EPC的数量和功能可以作为反映EC的标志物[2]。本文分为动物实验和临床观察两个部分,首先在前期研究的基础上,建立脑缺血再灌注模型,在中药脑脉通的干预下分别采用α-smooth muscle action(α-SMA)和CD133作为血管平滑肌细胞((vascular smooth muscle cells,VSMC))和血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPS)的标记,来反映大鼠脑缺血后梗死区的血管新生。同时对脑脉通治疗老年脑梗死患者的临床进行评价分析,并检测老年脑梗死患者外周血CD133的表达,探索脑脉通对脑缺血损伤的作用。本课题对深入研究老年患者缺血性脑卒中的病理生理特点,探索中医药治疗缺血性脑卒中的作用途径和在血管生成方面的影响,具有重要的社会意义及医学价值。目的1.以SD大鼠为研究对象,应用线栓法制备局灶性大脑中动脉脑缺血动物模型,观察I/R损伤后青年和老龄大鼠脑缺血(I)3h再灌注(I/R)24h、3d、6d、12d脑血管超微结构变化,并研究脑脉通对老龄大鼠I/R的保护作用;2.通过研究青年模型组、老龄模型组、尼莫地平组、脑脉通组大鼠I3h、I/R24h、I/R 3d、I/R 6d、I/R 12d大脑皮质区半暗带微血管α-SMA的表达变化,揭示老龄大鼠I/R脑微血管生成的特点及脑脉通对其影响;3.通过研究青年模型组、老龄模型组、尼莫地平组、脑脉通组大鼠i3h、i/r24h、i/r3d、i/r6d、i/r12d缺血区cd133阳性表达,探索老龄大鼠i/r微血管生成的特点,揭示血管内皮祖细胞与血管再生的关系及脑脉通对其影响;4.通过观察老年脑梗死患者入院当天、治疗第14天、治疗第28天nhiss量表评分及中医症状量化表评分,研究脑脉通对老年脑缺血患者神经功能的影响;5.通过检测老年脑梗死患者入院当天、治疗第14天、治疗第28天外周血cd133阳性表达百分比的变化,研究老年脑梗死患者外周血cd133的表达变化及脑脉通对其影响。方法1.采用mca线栓法制备大鼠局灶性脑缺血(i)3h再灌注(i/r)24h、3d、6d、12d动物模型,通过电镜观察各组大鼠在脑i/r后不同时间点脑组织超微结构变化,探讨脑脉通对老龄大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织病理改变的影响;2.采用mca线栓法制备大鼠局灶性脑缺血(i)3h再灌注(i/r)24h、3d、6d、12d动物模型,运用免疫组织化学方法比较各组大鼠在i3h、i/r1d、i/r3d、i/r6d、i/r12d后大脑皮质区半暗带微血管α-sma的表达变化,研究脑脉通对老龄大鼠i/r微血管α-sma表达变化的影响;3.采用mca线栓法制备大鼠局灶性脑缺血(i)3h再灌注(i/r)24h、3d、6d、12d动物模型,运用免疫组织化学方法比较各组大鼠脑缺血3h再灌注1d、3d、6d、12d后大脑皮质区半暗带cd133表达变化,研究脑脉通对老龄大鼠i/r脑组织cd133表达的影响;4.对入选的72例缺血性脑卒中患者进行临床观察,在常规治疗的基础上,分为脑脉通组和对照组,测各组患者入院当天、治疗第14天、治疗第28天nhiss量表评分及中医症状量化表评分,研究脑脉通对老年脑缺血患者神经功能的影响;5.用流式细胞仪检测入选患者入院当天、治疗第14天、治疗第28天外周血cd133阳性标记,研究脑脉通对老年脑梗死患者外周血cd133表达的变化的影响。结果1.老龄大鼠脑缺血再灌注后脑组织超微结构的变化及脑脉通对其影响青年假手术组大鼠电镜观察结果示血管基底膜连续完整,内皮细胞形态结构正常,线粒体结构清晰,胞浆内见吞饮小泡;青年模型组可见基膜、线粒体及血管周围不同程度的水肿,在i/r1d、i/r3d程度最重,i/r6d、i/r12d逐渐减轻;老年假手术组微血管周围无明显水肿,线粒体结构基本完整,吞咽小泡减少;老龄模型组可见血管周围、细胞质及线粒体水肿,尤以i/r3d最重;尼莫地平组内皮细胞线粒体水肿,尤以i/r12d最重;脑脉通组可见管周围轻度水肿,内皮细胞线粒体水肿,在i/r12d明显减轻。2.老龄大鼠脑i/rα-sma蛋白表达时程变化及脑脉通对其表达的影响由实验结果发现:青、老年假手术组均可见α-sma少量阳性表达;青年模型组i/r1d时阳性表达开始上升,i/r6d、i/r12d维持在较高水平;与青年模型组相比较,老龄模型组i3h、i/r1d、i/r3d、i/r12d表达均低于青年模型组(p<0.05,p<0.01);与老龄模型组相同时间点比较,脑脉通组和尼莫地平组α-sma阳性表达都高于老龄模型组(p<0.05)。3.老龄大鼠脑i/rcd133蛋白表达时程变化及脑脉通对其表达的影响由实验结果发现:青、老年假手术组均可见cd133少量阳性表达,在i/r1d时阳性表达开始上升,i/r6d最高,i/r12d开始下降;与青年模型组比较,老龄模型组相同时间点cd133的表达较低,在i/r3d、i/r6d时具有统计学意义(p<0.05,p<0.01);与老龄模型组同时间点相比,尼莫地平及脑脉通组大鼠脑组织cd133阳性表达水平均增高(p<0.05,p<0.01);与尼莫地平组同时间相比,脑脉通组i3h、i/r1d、i/r3d、i/r6d、i/r12d大鼠脑组织cd133阳性表达水平增高,但无统计学意义。4.脑脉通对脑梗死患者nhiss量表评分及中医症状分级量表变化的影响经临床观察发现:与对照组相同时间点比较,治疗14天、治疗28天脑脉通组nhiss量表评分低于对照组(p<0.05.);与对照组相同时间点比较,治疗14天、治疗28天脑脉通组中医症状分级量表评分低于对照组(p<0.05.)。5.脑脉通对老年脑梗死患者外周血cd133的表达时程变化的影响经流失细胞仪检测发现:老年脑梗死患者14d外周血cd133表达最多,并且脑脉通组高于对照组(p<0.01),28dcd133表达较14天降低(p<0.01),仍高于入院当天(p<0.01)。结论1.在遭受相同条件的i/r损伤时,与青年模型组相比,老龄模型组相应时间的大鼠损伤出现较早,损伤较重,恢复慢;与老龄模型组相比,脑脉通组和尼莫地平组脑组织病理损伤程度较轻,尤以脑脉通组大鼠脑组织损伤程度最轻,修复最快,提示脑脉通可明显改善老龄大鼠脑i/r后组织的损伤,并促进神经功能修复;2.老龄大鼠脑i/r损伤后,脑组织内可见微血管生成标记物α-sma蛋白的表达,且随脑i/r时间的延长,表达逐渐增多;与老龄模型组相比,脑脉通组和尼莫地平组相对应时间点α-sma蛋白的表达水平增高,尤以脑脉通组显著,提示脑脉通促进老龄大鼠脑i/r后微血管生成;3.老龄大鼠脑i/r损伤后,脑组织内可见微血管生成标记物cd133蛋白的表达,且随脑i/r时间的延长,表达逐渐增多,i/r12d时开始下降;与老龄模型组相比,脑脉通组和尼莫地平组相对应时间点cd133蛋白的表达水平增高,尤以脑脉通组显著,提示脑脉通促进老龄大鼠脑i/r后微血管生成;4.老年脑缺血患者在发病急性期nhiss量表评分及中医症状分级量化表评分最高,随着脑缺血时间的延长,评分逐渐降低,脑脉通组比较明显,提示脑脉通可以改善老年脑缺血患者神经功能;5.老年脑缺血患者在发病急性期外周血可见CD133表达,在治疗14天阳性表达最高,治疗28天有所下降,脑脉通组比较明显,提示脑脉通可以促进老年患者脑缺血后血管生成。