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肿瘤是严重危害人类健康的疾病，统计资料显示恶性肿瘤是中国城乡居民的首要死因。目前治疗肿瘤的两种常用方法一化学治疗和放射治疗，都存在着较大的毒副作用，寻找治疗效果好且毒副作用小的肿瘤治疗药物已成为当务之急。肿瘤生长转移依赖于血管生成，缺少新生血管的人体肿瘤往往被限制在很小的范围，抑制肿瘤血管生成是治疗恶性肿瘤的新思路。Thromspondin(TSP)基因家族成员普遍含有TSR结构域，它己被证实具有抑制血管生成的功能。本研究克隆的三个基因(IMAGE ID分别为LIFESEQ90208616、5169941、4733444)来自于OpenBiosystems，它们属于TSP基因家族成员的EST，编码产物含有TSR结构域，可望作为抑制肿瘤血管生成的基因治疗剂。
研究目的：寻找IAFESEQ90208616、5169941、4733444基因编码产物中保守的TSR结构域：试验基因5169941在动物体内的表达效率及其毒副作用。
实验方法：本研究以Invitrogen公司的真核表达质粒pcDNA6/myc-his B为基础，通过绿色荧光蛋白(EGFP，enhance green nuorescent protein)基因与标签多肽基因融合的方式，构建成一个能够同时整合EGFP、myc抗原表位和6×His抗原表位功能的新型真核质粒表达载体，我们将其命名为pcDNA6/myc-his-EGFP B。为确保目的基因与EGFP基因融合后，融合表达产物各组成部分能够保持原有的生物活性，我们运用LINKER程序在EGFP基因的5’端设计了一段编码八肽的DNA连接序列。用同源建模软件Modeller8V2模拟人类白细胞介素2(IL-2，humaninterleukin 2)与EGFP、myc抗原和6×His融合蛋白的三维结构，验证LINKER程序设计的连接多肽的柔韧性。通过同源性分析寻找基因LIFESEQ90208616、5169941、4733444的表达产物中的保守结构域。将这三个基因的编码序列亚克隆进pcDNA6/myc-his-EGFP B的多克隆位点中，使之分别与EGFP、myc抗原和6×His基因融合，构建成的质粒分别命名为pMHE1382、pMHE1010、pMHE1011。用pMHE1010尾静脉注射Balb/c小鼠，观察基因5169941在动物体内的表达效率与表达分布情况。用pMHE1010尾静脉注射SD大鼠，5d后取血进行生化和常规检测，取肝脏和胰脏进行病理切片分析。
结果：同源建模结果表明融合蛋白中IL-2、EGFP、myc和6×His各部分互不干扰，连接八肽具有一定的柔性。同源性分析发现基因LIFESEQ90208616、5169941、4733444的表达产物中含有保守的结构域一TSR，由此，我们判断这三个基因是TSP基因家族成员的EST，预测它们具有抑制血管生成的功能。用pMHE1010尾静脉注射Balb/c小鼠，8h后在小鼠肝脏冰冻切片中观察到绿色荧光，表明基因5169941能在动物肝脏中高效表达。用pMHE1010尾静脉注射SD大鼠，造成了血糖(GLU)和白蛋白(ALB)的显著升高，但并未造成血常规指标的显著变化，肝脏和胰脏的病理切片分析亦未见异常。由此表明，5169941基因在大鼠体内过量表达并不产生毒性，可望作为抑制肿瘤血管生成的候选基因治疗剂。