作为目前蛋白质翻译后修饰分析的主要技术手段,“自下向上”的蛋白质组学策略是以蛋白质酶切后的肽段为质谱分析对象。在质谱分析前,蛋白质样品的高效、完全酶切是蛋白质组成功分析的关键步骤。传统的溶液酶切或胶内酶切一般需要进行12-16小时,极大限制了蛋白质组的快速和高通量分析。蛋白质磷酸化和糖基化是两种最为常见和重要的蛋白质翻译后修饰。由于极低的丰度,磷酸肽/糖肽的质谱分析往往受到大量非磷酸肽和非糖肽的干扰,导致低的离子化效率和质谱响应。借助功能化材料开发针对低丰度翻译后修饰蛋白/肽段的特异性富集方法,是翻译后修饰蛋白质组综合、深度分析的关键。为此,本文围绕功能化共价有机骨架材料的合成及其在蛋白质组研究中的应用,开展了以下工作:新型固定化酶反应器研究:通过将蛋白酶固定在固相支撑物上制备固定化酶反应器,可有效改进耗时昂贵的传统酶切技术。通过两步溶液热反应,制备了 TpPa-1共价有机骨架材料包覆磁性石墨烯复合材料,并作为新型固相载体用于胰蛋白酶的高效共价固载,胰酶负载量可高达268μg mg-1。得益于磁性石墨烯和共价有机骨架材料的优异性能,该新型固定化酶反应器(MG@TpPa-1-trypsin)成功应用于标准蛋白质的酶解消化,酶解牛血清白蛋白5分钟序列覆盖率可达89%,显著高于12小时传统溶液酶切(75%),同时固定化酶储存稳定性、底物动态浓度范围和可重复使用性显著提高。蛋白质的完全消化甚至可在2分钟内完成。将制备的固定化酶反应器用于复杂样品长柄扁桃蛋白的酶切消化和液相色谱-质谱分析,酶解20分钟共鉴定到2833个蛋白质,略高于12小时的传统溶液酶切(2739个蛋白质)。新型功能化磷酸肽富集材料研究:目前虽然已有大量的功能化材料可用于质谱分析前磷酸肽的选择性富集,然而,多数材料繁琐复杂的合成方法有待进一步改进。本文在不需要任何额外螯合配体的前提下,可简单地将钛离子直接螯合到TpPa-2共价有机骨架材料上,制备了一种新型的基于共价有机骨架材料的固定金属离子亲和材料(TpPa-2-Ti4+)。通过扫描和透射电镜可观察到新材料呈微-纳分级结构的花状形貌。新制备的钛离子修饰共价有机骨架材料用于标准蛋白的磷酸肽富集时,对β-酪蛋白表现出低的检出限(4 fmol)和满意的选择性(β-酪蛋白:牛血清白蛋白= 1:100)。采用该富集材料可分别从α-酪蛋白酶切产物或α-酪蛋白和牛血清白蛋白酶切产物混合物(1:50)中鉴定到18条和17条磷酸肽。将该新型固定金属离子亲和材料用于复杂实际样品,可从脱脂牛奶酶解产物中分离鉴定到12条磷酸肽,三次重复实验共从HeLa细胞酶解产物中分离鉴定到源自2632个磷酸化蛋白的7432条磷酸肽,任何单次实验中鉴定到的磷酸肽数目均显著高于经典DHB/Ti02法(2286条磷酸肽)。新型N-糖肽亲水选择性富集材料研究:鉴于糖基化肽段含量低,且在质谱分析时易受到非糖肽的干扰,给糖肽分析带来巨大挑战,因此,质谱分析前对糖肽选择性富集材料的研发和策略的开发是糖基化蛋白质组分析的先决条件。在我们的工作中,仅需两步溶剂热反应,通过TpPa-1共价有机骨架材料在磁性纳米颗粒表面上的原位生长制备了一种具有超顺磁性的海胆状磁性共价有机骨架材料(Fe304@TpPa-1)。该新型复合材料可成功用于N-糖肽的亲水选择性富集,分别从人免疫球蛋白G和辣根过氧化物酶酶解产物中富集鉴定到37条和22条N-糖肽,同时表现出超低的检出限(28 fmol)、满意的选择性(人免疫球蛋白G:牛血清白蛋白=1:100)和高回收率(86.3%-94.3%)。经三次独立的重复实验,共从人血清酶解产物中鉴定到源自114个N-糖蛋白的228条N-糖肽,结果优于市售亲水材料(105个N-糖蛋白和195条N-糖肽)。