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谷胱甘肽(GSH)是一低分子量的三肽硫醇，在植物、哺乳动物、真菌以及原核生物等细胞中均广泛存在，并因其重要的生理功能而在食品、保健品、医药等多行业得到了广泛应用。 本研究利用多聚磷酸激酶(PPKs)和谷胱甘肽双功能合成酶(GshFs)构建GSH体外生物合成的偶联系统。首先，根据已知GshFs和PPKs序列在蛋白数据库中初步筛选Streptococcus sp.DD12、Streptococcus equinus、Clostridium thermobutyricum、Pediococcus inopinatus四种来源的GshFs(GshFSD、GshFSE、GshFCT和GshFPI)和Haloferax sulfurifontis、Pseudonocardia thermophile、Roseofilum reptotaenium、Prochlorococcus marinus、Meiothermus ruber、Jhaorihella thermophilaf、Hydrogenophilaceae bacterium、Nocardioides dokdonensis八种来源的PPKs(PPKHS、PPKPT、PPKRR、PPKPM、PPKMR、PPKJT、PPKHB和PPKND)，进行了蛋白表达与纯化。研究四种不同来源GshFs的酶学性质发现，在最优反应条件下GshFSS具有最高的酶活力。利用GshFSS-PPK偶联反应，比较八种来源的PPKs活性，其中PPKPT、PPKHS、PPKRR和PPKHB四种活性相对较高。并进一步对这四种PPKs和GshFSS进行偶联反应，分别研究了温度、pH、Mg2+和polyP浓度对GSH积累的影响，发现PPKHB-GshFSS偶联体系体外合成性能最佳。对GshFSS和PPKHB进行偶联反应的体系放大，首先进行了5mL体系的放大，发现批反应的效果最佳，在优化了Mg2+和polyP的添加比例后，最终得到GSH的实际得率为67％，后续成功放大到50mL，最终的GSH实际得率为86％，生产强度为107mM/h，产量为73.6mM。 此外，本研究还尝试进行GshFSS的固定化，在对多种固定化载体进行筛选的基础上，发现氧化石墨烯(GO)纳米材料对GshFSS的固定化效果最好。对酶固定化反应过程中的诸多参数进行了优化，并对固定化酶的酶学性质进行了表征，发现固定酶的蛋白加载率达到约90％且酶活回收率也有45％，温度和pH适应范围均得到了进一步拓宽。研究了固定酶的贮存稳定性，发现在常温条件下贮存，游离酶在第三天就几乎完全失活，而固定化酶仍保留约63％的酶活力。