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缺血性脑卒中以其高发病率、高死亡率和高致残率成为影响全球健康的首要杀手。脑血流一旦被阻塞超过数分钟,神经细胞便发生不可逆的损伤和死亡。人参皂甙(Ginsenoside Rd,GSRd)是从三七、人参中提取的有效单体成分,本课题组前期的实验显示GSRd除了可以促进大鼠MCAO后梗死灶周围的微血管发生,还可以促进体外培养人脐静脉微血管内皮细胞(human umbilical vein microvascular endothelial cells,HUVECs)的管腔形成,并初步发现GSRd的作用与Hif-1α的激活相关。本课题拟应用免疫组化、Western blot、人脐静脉微血管内皮细胞培养等技术,分别在体内和体外,进一步探讨GSRd的促血管发生作用机制是否与信号通路AKT-mTORHif-1α-VEGF的序列性激活相关。实验一人参皂甙Rd对成年大鼠脑梗死后血管发生的影响目的:进一步验证GSRd对成年大鼠脑梗死后血管发生的影响。方法:160只成年雄性Sprague-Dawley大鼠,体重280~300g,采用MCAO模型,随机分为4组:Sham+SA组,Sham+GSRd组,MCAO+SA组,MCAO+GSRd组。造模成功6 h后开始腹腔注射GSRd 10 mg/kg/d,连续7 d,MCAO对照组给予同体积生理盐水,并分别在PSD 1、PSD 3、PSD 7、PSD 14和PSD 21留取大鼠脑标本行冰冻切片,用RECA-1单克隆抗体分别标记不同时间点大鼠的微血管,观察缺血半暗带区微血管的密度和分支点的变化。结果:各Sham组之间微血管密度和分支点无变化(P>0.05,Sham+SA组vs.Sham+GSRd组);MCAO+SA组微血管的密度和分支点在PSD 1明显减少(P<0.05),在PSD 3、PSD 7和PSD 14时微血管的密度和分支点呈逐渐上升的趋势,并且在PSD14达到峰值,PSD 21有所下降(MCAO+SA组vs.Sham组);MCAO+GSRd组微血管密度和分支点在各时间点的变化趋势和MCAO+SA组基本一致,但其微血管密度和分支点在每个时间点均高于MCAO+SA组(P<0.05,MCAO+GSRd组vs.MCAO+SA组)。结论:GSRd可明显促进大鼠脑梗死后微血管的发生。实验二人参皂甙Rd对成年大鼠脑梗死后血管发生的机制研究目的:探索GSRd促进血管生长因子靶点是否包括Hif-1α的上游因子AKT和mTOR,进而探讨GSRd是否通过激活信号通路AKT-mTOR-Hif-1α-VEGF而发挥促血管发生的作用。方法:(1)成年雄性SD大鼠随机分为4组:Sham+SA组,Sham+GSRd组,MCAO+SA组,MCAO+GSRd组。MCAO模型成功后6 h开始腹腔注射给药GSRd 10 mg/kg,连续给药3 d。在PSD 3,应用Western blot检测半暗带区脑组织中的VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT的蛋白表达水平。(2)成年雄性SD大鼠随机分为3组:MCAO+SA,MCAO+GSRd,MCAO+GSRd+雷帕霉素。造模30 min前腹腔注射雷帕霉素250 ug/kg,后再连续给药2 d,MCAO模型成功后6 h腹腔注射GSRd 10 mg/kg,连续3 d后,用Western blot检测半暗带区脑组织中的VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT的蛋白表达变化,观察雷帕霉素抑制mTOR的激活后,其下游因子表达的情况。(3)成年SD大鼠随机分为3组:MCAO+SA组,MCAO+GSRd组,MCAO+GSRd+LY294002组。侧脑室立体定位埋入脑室套管,待大鼠恢复5 d后行MCAO模型,每天经脑室套管注射AKT抑制剂LY294002(10 m M,5 ul),腹腔注射GSRd10 mg/kg/d,两者均连续3 d,用Western blot检测半暗带区脑组织中VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT的蛋白表达变化。(4)分组同(3),大鼠连续用LY294002和GSRd,方法同(3),连续给药7 d脑组织冰冻切片后,用RECA-1单克隆抗体免疫组化染色,观察LY294002对大鼠微血管的影响。结果:(1)在PSD 3,Sham组之间VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT的表达无差别(P>0.05,Sham+SA组vs.Sham+GSRd组);MCAO后VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT的表达均下降(P<0.05,MCAO+SA组vs.Sham组);GSRd可明显促进VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT的表达(P<0.05,MCAO+GSRd组vs.MCAO+SA组)。(2)在加入mTOR特异性阻断剂雷帕霉素后,mTOR的活化形式p-mTOR以及其下游Hif-1α和VEGF的表达均明显降低(P<0.05),而其上游p-AKT的表达不受影响(P>0.05,MCAO+GSRd+雷帕霉素组vs.MCAO+GSRd组)。(3)在加入AKT抑制剂LY294002后,p-AKT、p-mTOR、Hif-1α和VEGF的表达均明显降低(P<0.05,MCAO+GSRd+LY294002组vs.MCAO+GSRd组);(4)LY294002可明显减少半暗带区微血管密度(P<0.01,MCAO+GSRd+LY294002组vs.MCAO+GSRd组=426.56±48.38 vs.532.03±16.17),同时减少分支点(P<0.01,MCAO+GSRd+LY294002组vs.MCAO+GSRd组=212.50±24.32 vs.330.47±20.44)。结论:在体内,GSRd促进血管发生的作用可能与AKT-mTOR-Hif-1α-VEGF信号通路激活相关。实验三人参皂甙Rd对体外培养人脐静脉微血管内皮细胞(HUVECs)的作用目的:在体外培养的HUVECs中探讨GSRd是否通过AKT-mTOR-Hif-1α-VEGF的激活而发挥促血管发生的作用。方法:(1)模型的建立。采用氧糖剥夺/再灌注损伤模型(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD)。体外培养HUVECs,实验分为5组:正常培养组、OGD组、OGD+GSRd 1 uM组、5 uM组、10 uM组。正常培养的HUVECs氧糖剥夺8 h,复氧12h后,吸取上清20 ul检测LDH释放量,向贴壁细胞的96孔板中加入CCK-8试剂测定细胞活性,贴壁细胞经消化后采用流式细胞仪检测细胞凋亡。(2)GSRd作用机制的探索。实验分为6组:正常组、OGD组、OGD+GSRd 1 uM组、OGD+GSRd 1 uM+2-ME2组、OGD+GSRd 1 uM+雷帕霉素组、OGD+GSRd 1 uM+LY294002组。OGD 8 h复氧12 h后,分别提取细胞总蛋白或核蛋白,通过Western blot检测VEGF、p-mTOR、p-AKT或Hif-1α的表达。结果:(1)OGD后细胞存活明显减少,细胞毒性和细胞凋亡明显增加(P<0.05,OGD组vs.正常培养组);1 uM和5 uM的GSRd干预后细胞存活均明显提高,毒性显著降低,凋亡明显减少(P<0.05,GSRd 1或5 uM组vs.OGD组),5 uM组和1 uM组之间无差别(P>0.05),而10 uM的GSRd干预后细胞存活却明显降低、凋亡比例显著上升(P<0.05,OGD+GSRd 10 uM vs.OGD+GSRd 1 uM)。(2)正常培养的细胞可表达VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT,OGD后VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT的表达均明显降低(P<0.05,OGD组vs.正常培养组);1 uM GSRd干预后上述因子的表达明显增高(P<0.05,GSRd 1 uM组vs.OGD组);分别加入Hif-1α抑制剂2-ME2、mTOR抑制剂雷帕霉素和AKT抑制剂LY294002后,Hif-1α和VEGF的表达均被明显抑制(P<0.05,OGD+GSRd+抑制剂组vs.OGD+GSRd组),雷帕霉素可显著抑制p-mTOR的表达但不能抑制其上游信号通路中p-AKT的表达,LY294002则可同时抑制p-AKT及其下游p-mTOR、Hif-1α和VEGF的表达。结论:在体外,GSRd促进血管发生的作用可能与AKT-mTOR-Hif-1α-VEGF信号通路的激活相关。