论文部分内容阅读
甲鱼是我国重要的水产养殖品种,而“红脖子病”是甲鱼养殖中的常见病症,发病死亡率超过40%,严重时会引起甲鱼大量死亡,给养殖业带来严重损失。本研究对患“红脖子病”的甲鱼进行病毒分离,对分离到的病毒进行了形态学研究和理化特性研究,并建立了分子生物学和免疫学检测方法。详细内容如下:1.病毒的分离及理化特性研究。取典型的“红脖子”症状甲鱼的肝脏,经处理后制备的上清液接种到CO、FHM、CK和GCK细胞上出现CPE,进行空斑实验和理化性质分析。形态学研究发现,该病毒为结果表明直径约120～160 nm,呈二十面体对称有囊膜的球形病毒颗粒,病毒对热（56℃30分钟）、pH3和pH9不稳定,对脂溶剂（氯仿）敏感。该病毒在有DNA抑制剂存在的条件下受到抑制而不能增殖,表明该病毒核酸类型为DNA。病毒能在CO、FHM、CK、GCK等细胞中增殖,但不能在CHSE、R1、PG细胞中产生CPE。在CO细胞中的滴度最高,CPE出现也较快。病毒在15～30℃范围内均能在CO细胞中增殖并产生CPE,但最适增殖温度为25-30℃。通过形态学及理化特性研究,将分离到的病毒确定为虹彩病毒科,并将分离到的病毒命名为甲鱼虹彩病毒（soft-shelled turtle iridovirus,STIV）)2.克隆了STIV主要衣壳蛋白基因,对其序列进行分析,结果表明其与蛙病毒属中的FV3、ATV MCP基因同源性最高,因此将分离到的病毒确定为虹彩病毒科蛙病毒属。在体外STIV感染过程中,MCP的时相的表达模式通过Western-blot和实时荧光PCR实验检测,结果表明MCP为晚期基因。将MCP片段插入pQE30表达载体中,在大肠杆菌中表达MCP,并制备兔抗MCP多克隆抗体,间接免疫荧光和病毒中和实表明MCP抗血清对STIV具有中和作用。3.根据MCP基因序列中的保守序列,设计引物和Taqman探针,建立了虹彩病毒蛙病毒属实时荧光PCR检测方法。对荧光定量PCR反应条件进行优化,评估该分析方法的特异性、稳定性和重复性。结果显示,该方法对虹彩病毒蛙病毒属成员（新加坡石斑鱼虹彩病毒除外）的检测有高度的特异性,与淋巴囊肿病毒（Lymphocystis）、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）、真鲷虹彩病毒（RSIV）、锦鲤疱疹病毒（KHV）等其他水生动物病毒之间均无交叉反应,检测总DNA灵敏度为4.5×100-3pg/μL。得到的标准曲线有极好的线性关系,且线性范围宽,相关系数为0.9984;组内和组间试验重复样品的CT值标准偏差分别1.2%和1.6%。4.根据STIV胸肝激酶基因的保守序列,设计了两条内引物和两条外引物,建立了STIV环媒恒温扩增技术（LAMP）检测方法。对LAMP扩增条件优化,结果表明最佳反应条件为63℃反应60min。使用牛蛙病毒（TFV）、狗鱼弹状病毒（PFR）、传染性胰腺坏死病毒（IPNV）、病毒性出血性败血症病毒（VHSV）、传染性造血器官坏死病毒（IHNV）、病毒性脑病和视网膜病病毒（VERV）、淋巴囊肿病毒（Lymphocystis）和真鲷虹彩病毒（RSIV）等主要水生动物病毒作为对照,评价LAMP方法的特异性,在蛙病毒属病毒毒株中均有扩增,检测其它病毒DNA时均为阴性。表明所建立的LAMP具有良好的特异性。灵敏度检测结果表明,LAMP检测比普通PCR扩增的灵敏度高100倍,比实时荧光PCR（real-time PCR）扩增的灵敏度低10倍。5.获得了4株可以稳定分泌STIV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备了兔抗STIV多克隆抗体,建立检测STIV病原的双抗夹心ELISA方法。该方法具有良好的特异性和敏感性。用该ELISA方法对128份临床样品进行检测,同时用PCR作为对照方法,结果表明该ELISA方法的特异性和敏感性分别为98.3%和100%;ELISA和PCR两种方法检测结果的符合率为98.4%。