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目的:本文拟通过制备不同刚度的三维(three dimension,3D)脱细胞基质(decellularized extracellular matrix,DECM)离体模拟人乳腺肿瘤组织微环境,探究基质刚度对乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231细胞活力和细胞浸润等生物学行为的影响。方法:构建干扰和过表达赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)基因的慢病毒载体,并分别转染乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231细胞,通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qPCR)和免疫印迹(Western blot)检测LOX mRNA与蛋白的表达。将表达不同量LOX的MDA-MB-231细胞注射裸鼠腋窝皮下,成瘤后经脱细胞方法得到3D DECM支架,并使用材料试验机测得其弹性模量。使用扫描电子显微镜观察DECM显微结构。通过石蜡切片及组织学染色进一步检测细胞外基质(extracellular matrix,ECM)重要组分。在不同刚度DECM进行再细胞化,利用Live/dead染色及MTS检测1、4、7与10天的细胞活力,通过苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色检测再细胞化7天后细胞浸润。最后通过qPCR检测再细胞7天后上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)间质标志物波形蛋白(vimentin)和转录因子(Snail 1)以及I型胶原(collagen I)、纤连蛋白(fibronectin)与LOX mRNA的表达。结果:经脱细胞法形成的不同刚度3D DECM完好保存了ECM组分与结构,再细胞化实验表明这种不同刚度的3D DECM对乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231细胞的生物学行为具有重要影响。(1)qPCR与Western blot结果表明:转染干扰LOX慢病毒载体的MDA-MB-231细胞中LOX基因与蛋白的表达被显著抑制,而过表达组中LOX表达量明显提升。(2)组织学染色结果表明:各组DECM中细胞被完全脱去,而且完整保持了ECM结构及胶原、糖胺聚糖等主要组分。(3)扫描电子显微镜及力学性能测定结果表明:对照组DECM孔隙率为48.47±5.27%,刚度为3.24±0.39 kPa;低刚度组的DECM孔隙率为增加为68.12±5.74%,刚度减小为2.57±0.26 kPa;相反地,高刚度组的DECM孔隙率减小为32.68±4.30%,刚度增加为4.91±0.31 kPa。(4)再细胞化实验结果表明:MDA-MB-231细胞可浸润至不同刚度的支架内部并且生长状态良好。(5)qPCR结果表明:高刚度组脱细胞基质促进MDA-MB-231 LOX mRNA的表达;低刚度组脱细胞基质促进vimentin mRNA的表达,抑制fibronectin mRNA的表达。结论:经构建的LOX过表达与干扰的慢病毒转染后,MDA-MB-231中LOX基因和蛋白的表达水平能够被有效调控,使得胞外基质胶原交联程度不同,从而引起DECM刚度的改变。再细胞化实验表明,DECM对细胞没有毒性作用。综上,本实验所制备的3D DECM支架可作为3D模型用于离体研究刚度对肿瘤细胞的影响。