肌酸激酶是动物细胞内参与能量运转、肌肉收缩、ATP再生的重要激酶。脑型肌酸激酶(Creatine Kinase Brain-type,CKB)在乳腺癌、卵巢癌、大肠癌及结肠癌等多种癌症中的表达呈现上调趋势,前期研究发现敲低CKB可以抑制卵巢癌细胞的生长代谢状态。NF-κB信号通路可以参与一系列与炎症发生、免疫应答相关基因的调控,该通路中的核心蛋白NF-κB主要以p65/p50二聚体的形式存在,作为转录因子在癌症的发生、发展中起着重要的作用。生物信息学预测CKB很有可能参与NF-κB信号通路的调控。本课题拟在此前的研究基础上,探究CKB对卵巢癌转移的影响,揭示CKB对细胞信号通路NF-κB的调控作用。主要研究结果如下:(1)CKB调控NF-κB信号通路的活性。以卵巢癌SKOV3细胞株为材料,通过RNA干涉技术转染si RNA敲低CKB的表达,发现多个与癌症转移相关基因的表达产物发生了显著的下调,这些基因大多数是NF-κB信号通路的下游基因,特别是NF-κB信号通路核心蛋白p65的水平也发生下调,而通过转染质粒过表达CKB后,则p65蛋白的水平呈现上调的趋势。SKOV3细胞中具有活性的磷酸化的p65和IκB的变化与CKB的变化一致,这表明改变CKB蛋白的表达会调控NF-κB信号通路的活性。(2)CKB通过影响p65蛋白泛素化水平调控NF-κB信号通路的活性。q RT-PCR结果显示,SKOV3细胞中上调或下调CKB蛋白的表达对p65蛋白的转录没有明显影响;而下调CKB蛋白的表达同时抑制新生蛋白质的合成,p65蛋白的半衰期缩短,上调CKB蛋白的表达则反之。Western blot结果证明,下调CKB蛋白表达增加了p65蛋白的泛素化的修饰程度,这说明敲低CKB可改变p65蛋白泛素化修饰加快其降解,从而降低NF-κB信号通路的活性。(3)CKB与p65蛋白的RHD结构域相互作用影响p65泛素化。免疫共沉淀实验表明,CKB蛋白和p65蛋白在SKOV3细胞中互作;利用带His标签的p65蛋白进行镍柱亲和结合实验,结果表明CKB能够与p65蛋白专一结合。进一步将p65的两个结构域RHD和CTD分别构建在质粒上转染SKOV3细胞,免疫共沉淀结果表明,只有RHD结构域可以与CKB结合,此结构域也是E3泛素连接酶(ING4或PPARγ)与p65的结合部位,在SKOV3细胞中上调CKB蛋白的表达,阻碍了这两种E3泛素连接酶与p65的结合,这些结果表明p65的RHD结构域与CKB的结合,在调控p65蛋白的泛素化降解过程中发挥了重要作用。(4)调控CKB蛋白的表达影响卵巢癌细胞体外迁移和侵袭。为了探究CKB蛋白的表达是否对SKOV3细胞迁移和侵袭有影响,我们利用慢病毒感染的方法构建了稳定敲低CKB蛋白表达的卵巢癌细胞(CKB-/--SKOV3),伤口愈合实验和Transwell小室迁移实验都表明,该细胞株在下调CKB蛋白表达后,细胞的迁移率发生了显著降低。Matrigel侵袭实验结果显示,敲低CKB蛋白的表达也抑制了细胞的侵袭能力。(5)调控CKB蛋白的表达影响卵巢癌细胞在小鼠体内的成瘤和转移。以慢病毒感染稳定敲低CKB蛋白的卵巢癌细胞(CKB-/--SKOV3)为材料,分别用皮下注射、腹腔注射的方法构建异种移植瘤和远处转移瘤裸鼠模型。实验结果表明,与正常表达CKB的SKOV3细胞相比,下调CKB蛋白表达的SKOV3细胞在裸鼠皮下成瘤的能力降低,肿瘤的体积和重量减少,腹腔内肿瘤转移灶的数目也明显降低。研究结果揭示了CKB对NF-κB这一经典信号途径的影响,对深入理解肌酸激酶的生理和病理功能打下了基础,也为卵巢癌药物的开发提供了新的靶点。