论文部分内容阅读
[目的]选择人前列腺干细胞抗原（prostate stem cell antigen,PSCA）作为治疗靶点,以本实验室自主研发的pVAX1-neo-Fc-GPI-IRES-GM/B7 DNA疫苗载体为基础,构建用于治疗前列腺癌的异种化PSCA融合抗原免疫增效DNA疫苗,评价以PSCA作为前列腺癌治疗靶点的可行性,并为前列腺癌,特别是激素非依赖性前列腺癌的治疗提供新策略。[方法]（1）检索GenBank,选择包含人主要T细胞抗原表位序列的人PSCA基因片段,应用异种化抗原设计技术,保留人T细胞抗原表位,设计异种化PSCA融合抗原片段;（2）根据核酸序列按中心模板法设计引物,应用重叠延伸PCR技术拼接合成异种化PSCA融合抗原片段基因,以PCR、限制性酶切和DNA序列测定法进行鉴定:（3）利用DNA限制性内切酶BssHⅡ和MluⅠ酶切后粘端互补的特点,采用同尾酶法构建1—4拷贝异种化PSCA融合抗原片段（PNCA1-PSCA4）,并将上述片段分别插入真核表达载体pCI-neo-Fc-GPI中,转染293T细胞,借助免疫荧光+流式细胞术考察插入片段表达效率,最终选定PSCA3片段进行下一步研究;（4）将sig-PSCA3-Fc-GPI基因片段自pCI-PSCA3-Fc-GPI质粒上切下,插入pVAX1-neo-IRES—GM/B7载体中,构建免疫增效DNA疫苗pVAX1-PSCA3-FcGB,并应用转染Cos7细胞+免疫荧光/流式细胞术方法鉴定其在真核细胞中的表达情况;（5）给8周龄雄性C57BL/6小鼠皮下种植RM-1细胞,制备小鼠前列腺癌模型,并采用股四头肌肌肉注射+电脉冲法（Electroporation,EP）接种DNA疫苗质粒pVAX1-PSCA3-FcGB,同时接种pVAX1空载体质粒和pVAX1-PSCA1-FcGB质粒作为对照,通过观察计算免疫动物的成瘤时间、肿瘤体积和抑瘤率,来评价该DNA疫苗在小鼠体内的抑瘤效果。[结果]（1）拼接合成了含有人主要T细胞表位的异种化PSCA融合抗原片段基因,经DNA测序证实与设计序列完全一致;（2）将异种化PSCA融合抗原片段进行1-4拷贝串联后,转染293T细胞+免疫荧光/流式细胞术结果证实PSCA3表达效率较高;（3）成功构建了免疫增效DNA疫苗pVAX1-PSCA3-FcGB,并通过转染Cos7细胞+免疫荧光/流式细胞术检测证明该疫苗可以在真核细胞中有效表达;（4）动物实验证明抗前列腺癌免疫增效DNA疫苗pVAX1-PSCA3-FcGB能够推迟RM-1细胞肿瘤的形成,但在抑制肿瘤生长方面效果欠佳。[结论]1.成功拼接合成了异种化PSCA融合抗原片段基因;2.构建了以PSCA为靶点的抗前列腺癌免疫增效DNA疫苗pVAX1-PSCA3-FcGB:3.该疫苗能够推迟RM-1细胞肿瘤的形成。