目的:血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）是脑内一种生理性屏障,能够调节离子和分子进出脑实质,维持中枢神经系统的稳定。BBB主要是由脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells,BMECs）、基底膜、星型胶质细胞的伪足以及周细胞组成。BMECs是构成血脑屏障的主要组成细胞,区别于其它组织的内皮细胞,BMECs具有紧密连接、黏附连接及低水平的胞吞胞吐的特性,这些特性限制了血液中小分子通过跨细胞和细胞间的运输穿过BBB进入脑内。BMECs膜表面也具有多种底物特异性的运输系统,能够转运离子,细胞代谢产物和特异性小分子。例如,定位于BMECs腔面的钠钾泵（也称Na⁺/K⁺-ATP酶）可以调节细胞中的钠离子进入脑间隙液中,同时将脑内钾离子泵入细胞中。P190是一种分子量为190KD的跨膜蛋白,最初发现其存在于有髓神经纤维郎飞节的节旁区。本实验室前期工作首次发现,P190在人脑微血管内皮细胞（HBMEC）的血管腔面表达,作为受体参与细菌侵袭并穿过BBB导致新生儿细菌性脑膜炎发生（Nature communications,2018）。为了进一步探讨HBMEC表达P190的生理学意义,我们以P190蛋白的胞内C末端结构域（80个氨基酸）为诱饵蛋白,酵母双杂交技术从小鼠胎脑cDNA文库中筛选出能够与P190发生相互作用的蛋白Na⁺/K⁺-ATP酶β3亚基（ATP1B3）。Na⁺/K⁺-ATP酶,又称钠钾泵,通过消耗ATP的同时向细胞内转运2个钾离子并向细胞外转运3个钠离子,从而维持细胞内低钠高钾的离子浓度稳态。Na⁺/K⁺-ATP酶主要由具有催化作用的α亚基和调节作用的β亚基构成。β亚基可以帮助α亚基运输定位在细胞质膜并行使Na⁺/K⁺-ATP酶转运离子的酶活性。本研究将明确P190与ATP1B3间相互作用的机制以及可能的生理学意义。方法:体外翻译（TNT）获得ATP1B3蛋白,GST-pull down检测P190蛋白胞内段和ATP1B3是否存在相互作用;免疫荧光检测P190、ATP1B3在HBMEC中的位置分布;Co-IP检测内源性的P190和ATP1B3是否存在相互作用;Western blot检测ATP1B3糖基化情况;HBMEC中采用瞬时干扰P190或shRNA稳定干扰的方法低表达P190蛋白后,细胞免疫荧光及Western blot检测ATP1B3和ATP1A1的表达;在稳定低表达P190的HBMEC中,Rescue实验恢复P190蛋白的表达后,Western blot检测ATP1B3和ATP1A1的表达情况;双光子激光共聚焦显微镜实时记录低表达P190蛋白的HBMEC内K离子荧光信号的变化;Na⁺/K⁺-ATPase活性试剂盒检测Na⁺/K⁺-ATPase的功能活性;利用Transwell培养稳定低表达P190的HBMEC模拟体外BBB模型,检测BBB转运谷氨酸能力的变化。结果:GST-pull down实验证明P190与Na⁺/K⁺-ATPaseβ₃亚基（ATP1B3）存在相互作用,而不与β₁亚基互作。细胞免疫荧光显示HBMEC中P190和ATP1B3在内质网区域存在共定位。HBMEC中ATP1B3是具有不同糖基化修饰形式的糖蛋白。免疫沉淀实验显示P190蛋白与未糖基化ATP1B3存在相互作用;HBMEC中稳定干扰P190蛋白表达后,ATP1B3糖基化修饰水平降低,细胞质膜的定位也减少。进一步受β₃亚基影响的α亚基（ATP1A1）也发生蛋白表达的下调及细胞膜定位的减少;稳定低表达P190蛋白的细胞株rescue P190蛋白后,能够恢复ATP1B3与ATP1A1的表达和细胞质膜上的定位。Elisa结果显示HBMEC中干扰P190能够降低Na⁺/K⁺-ATPase的活性。应用双光子激光共聚焦显微镜检测HBMEC中低表达P190蛋白后,Na⁺/K⁺-ATPase转运钾离子的相对速度和总量均显著降低。Transwell培养稳定干扰P190细胞模拟体外BBB模型,同正常细胞相比,该细胞对谷氨酸从基底面到腔面的的转运能力下降。结论:脑微血管内皮细胞中P190蛋白与未糖基化的ATP1B3发生相互作用,其生理意义是促进ATP1B3在脑微血管内皮细胞中的糖基化修饰（即ATP1B3的成熟）。P190介导的ATP1B3的成熟促进Na⁺/K⁺-ATP酶α₁亚基的装配及Na⁺/K⁺-ATP酶的细胞膜定位。同时,P190调控Na⁺/K⁺-ATP酶的离子转运活性,并有利于脑微血管内皮细胞将脑内过量的谷氨酸转运到血液中。