猪血红蛋白的提取及修饰的初步研究

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从新鲜猪血出发,经过超速离心,微孔滤膜过滤等步骤分离纯化得到无基质猪血红蛋白。猪血红蛋白纯化的产物经SDS—PAGE方法分析显示只有一条条带,证明了无基质血红蛋白容易发生四聚体的解聚现象,测定了无基质猪血红蛋白的半饱和氧分压(P50)和希尔系数(n)等有关猪血红蛋白(pHb)携氧能力的参数,并考察了别构效应调节剂对pHb携氧能力的影响。 用小分子试剂双(3,5—二溴水杨酸)延胡索酸酯(DBBF)对pHb进行修饰。与天然血红蛋白相比,DBBF修饰后的血红蛋白具有抗解聚的特性,经SDS—PAGE分析发现DBBF修饰产生的衍生物存在血红蛋白亚基之间的交联。比较了修饰时pHb所处的空间构象(脱氧状态的T构象和氧合状态的R构象)、修饰剂的用量、修饰时间等条件对DBBF修饰pHb的影响,并且DBBF对pHb的修饰还受到别构效应调节剂的影响。 PEG大分子化pHb是延长其在循环系统中的停留时间、降低免疫原性、减少肾脏毒性的有效办法,而PEG修饰一般都使pHb携氧能力下降。我们比较了4种不同方法活化的PEG衍生物对pHb修饰产物携氧能力的影响,还研究了修饰时pHb所处构象对修饰的影响,又用PEG修饰用DBBF内交联的pHb,考察了PEG用量,修饰时间,修饰温度,修饰缓冲液pH值等不同条件对修饰衍生物的携氧能力的影响。在有别构效应调节剂存在的条件下,用DBBF内交联处于脱氧状态的pHb(T态),再用PEG修饰,可以得到携氧能力好,分子量适宜,四聚体稳定的修饰产物。
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