烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)是卵菌纲的一种土传植物病原菌,广泛存在于温带、亚热带和热带,可侵染包括烟草、番茄、柑橘、杏等90多个科250多个属的1000多种植物。烟草疫霉破坏性极强,由其引起的病害严重危害着作物的生长和生理,给农业生产造成了巨大经济损失,因而是一种备受关注的土传植物病原菌。然而,目前尚无有效的方法来控制这种土传病害的传播。研究发现烟草疫霉产孢子囊和释放游动孢子是导致寄主病害发生与流行的主要原因。因此加强烟草疫霉孢子囊产生及游动孢子释放机制的研究,减少和控制烟草疫霉产生孢子囊,对防控烟草疫霉病害发生具有重要意义。本实验室前期研究发现,0.5 mM硼极显著抑制烟草疫霉孢子囊的产生,并发现硼在抑制烟草疫霉产孢子囊时显著抑制了一个与致病疫霉基因组测序推导的COP9信号复合体CSN4亚基同源的基因表达,然而其抑制机理并不清楚。为此本文分析研究了烟草疫霉抗氧化系统和csn4基因对硼抑制的响应,以及csn4基因在烟草疫霉不同生长发育时期的转录特征,结果表明硼显著改变了烟草疫霉的抗氧化系统,csn4基因转录量在烟草疫霉产孢子囊时期显著高于其它时期,添加硼处理会显著抑制烟草疫霉产孢子囊时期csn4基因的转录。研究结果证明了COP9信号复合体CSN4亚基与烟草疫霉产孢子囊有关,为控制烟草疫霉孢子囊的产生提供理论基础。主要取得了如下研究结果:(1)硼对烟草疫霉产孢期抗氧化系统影响的研究结果表明,硼处理组烟草疫霉产孢期的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性显著(p<0.05)低于无硼处理,相反,所有硼处理组均使得丙二醛(MDA)含量增加,而MDA作为细胞氧化的终产物,其含量的升高说明活性氧积累,细胞处于氧化应激状态。综合分析表明硼胁迫使得菌体抗氧化酶活性降低,导致细胞处于氧化应激状态,而不能正常发育。(2)通过对引物等的优化,本实验建立了csn4基因的相对定量方法。采用beta-tubulin基因作为内参基因,分别对两基因的引物进行设计并筛选,最终各获得一对特异性良好的引物,并分别构建了两基因的重组质粒,最终建立了csn4和beta-tubulin基因的实时荧光定量标准曲线,其回归方程分别为y=-4.007x+26.889、y=-4.109x+28.453,相关系数R2分别为0.9976、0.9936。采用Ecsn4/Etub的值(Ecsn4和Etub分别表示csn4和beta-tubulin基因的转录量)来表示csn4基因的转录水平,此方法有效的消除了不同处理样品模板量差异对实验结果的影响,并且本研究证明了该定量方法的可行性。(3)不同浓度硼处理下烟草疫霉产孢期csn4基因转录的定量分析结果表明,硼处理组烟草疫霉产孢期csn4基因转录水平显著低于无硼处理,且低浓度的硼处理(0.5 mM)就可显著抑制csn4基因的转录,其抑制率达到40%左右,随硼浓度的变化,csn4基因转录水平差异不显著。(4)对烟草疫霉不同时期csn4基因转录的定量分析结果显示,烟草疫霉从菌丝生长阶段到产孢阶段,csn4基因的转录水平显著升高,且诱导产孢阶段以及游动孢子释放阶段csn4基因的转录水平均显著高于菌丝生长及游动孢子阶段。烟草疫霉csn4基因不同时期转录水平大小顺序为:产孢阶段>游动孢子释放>菌丝生长>游动孢子阶段。在诱导产孢阶段中,随诱导产孢时间的延长,csn4基因的转录水平升高,当诱导12 h时达到最高水平,相当于菌丝生长阶段csn4基因转录量的4倍左右。综合以上结果表明,csn4基因参与烟草疫霉的整个生命过程,但主要参与烟草疫霉的发育产孢阶段,且在诱导产孢12 h时可能是孢子囊物质大量合成的阶段。