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恶性肿瘤为多因素、多阶段形成，其生物学特性表现为浸润性生长和转移，其发生机制在于细胞内部基因结构和功能发生了异常改变。在肿瘤发生多阶段癌变过程中，癌基因的激活和／或抑癌基因的失活为其中两个重要的分子学事件。现代肿瘤理论认为，在肿瘤的形成过程中包含两大类机制，一个是遗传学层面，即通过DNA核苷酸序列改变而形成突变；另一个就是表遗传学（epigenetics）层面，其研究的对象是基因表达的变化，这种变化可通过减数分裂遗传，但不涉及有关基因DNA序列的改变。尽管不存在DNA核苷酸序列的改变，但通过DNA自身化学修饰方式从转录水平影响基因的表达，调控DNA功能，此机制在肿瘤的形成过程中越来越受到重视。DNA甲基化是表遗传学上研究最深入的一种机制，是由甲基转移酶介导，将胞嘧啶变为S—甲基胞嘧啶的一种反应。肿瘤学研究发现，启动子区高甲基化异常是导致许多肿瘤抑制基因表达异常的内在机制。相对于引起结构异常的基因变异机制，属于表观遗传学机制的DNA甲基化模式随着细胞分裂可得到稳定复制和遗传，而同时甲基化的异常更易于被逆转，在癌变过程中，使异常甲基化逆转，特别是在癌变早期阶段的转变，对于肿瘤的防治尤为重要。由于高度甲基化而暂停表达的抑癌基因，如果能应用去甲基化制剂逆转甲基化的异常状态，使之重获表达，理论上即可发挥其抑制肿瘤细胞生长的功能。DNA甲基化调节基因表达，某些抑癌基因在肿瘤发生中存在着高甲基化而失活均已得到广泛证实。本研究选用5-氮-2′-脱氧胞苷（5Aza-dc）作为去甲基化制剂处理前列腺癌癌细胞株DU-145，5Aza-dc是一种嘧啶类似物，由对2′-脱氧胞嘧啶第S位碳置换为氮获得，在与复制过程中的DNA分子结合时，该制剂可与DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferasel，DNMT1）形成一个共价复合物，抑制该酶的甲基转移活性，从而导致形成低甲基化的子链，实现去甲基化功能。体外实验已经证实DNA甲基转移酶抑制剂5Aza-dc通过去甲基化作用可使多种含有CpG岛的高甲基化抑癌基因重新表达，从而恢复抑癌功能，这一研究结果对于肿瘤的基因治疗提供了一个新的思路。前列腺癌治疗中应用相应的去甲基化制剂以改变前列腺癌细胞的生物学行为的研究，目前尚未见报道。前列腺癌肿瘤抑制基因的失活进而导致蛋白表达下降的机制尚不是十分明确，国内的系统研究甚少。RASSF1A基因是2000年确认的一新型抑癌基因，研究发现，RASSF1A作为抑癌基因，它的转录因子可以抑制CyclinD1的积聚而控制细胞周期G1期向S期转变而抑制肿瘤生长。RASSFIA基因失活使其表达缺失，丧失了负性调控细胞周期的功能，细胞易于发生恶性转化，促进肿瘤的发生与发展。RASSF1A基因失活存在于多种肿瘤发生及发展中，但RASSF1A基因缺失在原发肿瘤中检出率很低，该基因表达失活主要机制是启动子区的5′CpG高甲基化，已经在包括前列腺癌细胞株Du145在内的广泛肿瘤谱中被证实。目的本研究旨在探讨前列腺癌的表遗传学发生发展机制，包括：1、甲基化抑制剂与多种化疗药物联合应用，探讨二者间的协同作用，增强化疗药物疗效；2、体外应用甲基化抑制剂对前列腺癌细胞DU145的RASSF1A基因甲基化水平的影响；3、体外应用甲基化抑制剂对前列腺癌细胞DU145的RASSF1A基因及蛋白表达的影响，以期为进一步深入探索通过改变抑癌基因的甲基化而为前列腺癌发生机制和基因治疗提供有意义的数据和理论依据。方法1、对已知存在RASSF1A基因甲基化的前列腺癌细胞DU145应用去甲基化剂5Aza-dc诱导处理，应用MTT法检测5Aza-dc及其他抗肿瘤药物对Du145细胞存活率的影响，应用流式细胞仪观察细胞凋亡率的变化。2、应用RT-PCR和MSP方法，比较甲基化抑制剂对人前列腺癌细胞处理前后RASSF1A基因mRNA和DNA表达水平。3、在5Aza-dc处理肿瘤细胞后，采用Western blot方法，对人前列腺癌细胞处理前后RASSF1A基因蛋白表达水平进行分析。结果1、应用MTT法及流式细胞术检测，5Aza-dc可抑制Du145前列腺癌细胞的增殖；细胞凋亡增加。5Aza-dc浓度分别为1.0、2.0和4.0μmol／L,当药物浓度达到1.0μmol／L时出现了对细胞的生长的抑制作用，在一定范围内随着剂量的增高，对前列腺癌细胞增殖的抑制作用越明显，5Aza-dc作用48h，前列腺癌细胞存活率分别为83.4％、62.8％、43.2％。流式细胞仪检测，5Aza-dc可以显著增高前列腺癌细胞的凋亡率，作用呈剂量依赖性，在浓度达到4.0μmol／L时效果最明显。2、MSP，RT-PCR，Western blot显示在应用5Aza-dc处理前，Du145前列腺癌细胞RASSF1A基因呈甲基化状态，RASSF1A基因mRNA及蛋白表达缺失，经1.0、2.0及4.0μmol／L的5Aza-dc作用48h后，MSP显示Du145前列腺癌细胞RASSF1A基因甲基化逆转；RT-PCR，Western blot显示RASSF1A基因mRNA及蛋白表达恢复。3、5Aza-dc与其他肿瘤化疗药物协同可显著增强对前列腺癌细胞Du145的杀伤作用。经MTT检测，30μg／mL，60μg／mL，120μg／mL及240μg／mL 5-FU，2μg／mL，4μg／mL，8μg／mL，及16μg／mL ADM作用48h，前列腺癌细胞存活率分别为92.3％、80.2％、73.5％和68.3％以及86.7％、73.5％、64.6％、58.2％加入终浓度为1.0μmol／L的5Aza-dc后，相同条件下细胞的存活率分别降为72.5％、57.1％、49.4％和42.5％；以及68.6％、53.2％、36.6％和28.7％。结论1、RASSF1A基因启动子甲基化是导致其失活的主要原因。2、5Aza-dc能较好地逆转前列腺癌细胞Du145的DNA异常甲基化，激活因高甲基化所致基因沉默的再转录，诱导该基因的表达。3、5Aza-dc能有效的诱导前列腺癌细胞Du145细胞凋亡。4、5Aza-dc与其他肿瘤化疗药物有协同作用，增强前列腺癌细胞Du145对化疗药物的敏感性。