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目的:研究LncRNA GAS5(Long non-coding RNA growth arrest-special 5)基因启动子区(promoter region)的一个功能性插入/缺失多态(rs145204276)与中国汉族人群肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)易感性的关联,并运用基因型-表型关联研究,分子生物学和表观遗传学方法探讨该多态在肝细胞肝癌发生发展中的作用及可能的分子机制。方法:(1)运用生物信息学工具筛选出位于LncRNA GAS5基因启动子区的多态位点,从中选取了一个具有潜在功能的五碱基插入/缺失(Indel)多态(rs145204276)作为候选多态位点。(2)采用病例对照研究方法(1034例HCC病例和1054例正常对照),PCR扩增联合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对候选多态位点进行基因分型,Logistic回归统计分析该多态位点与HCC易感性的关联。(3)运用Real-time PCR技术检测HCC组织中LncRNA GAS5的表达量,并分析rs145204276多态不同基因型与对应组织中LncRNA GAS5的表达量之间存在的基因型-表型关联。(4)构建含有rs145204276插入/缺失多态的重组质粒pGL3-GAS5-WT/MT,转染三种肝癌细胞系(Huh-7,BEL-7404和SK-HEP-1),通过双荧光素酶报告基因系统检测不同处理组细胞的荧光素酶活性,进一步探讨该插入/缺失多态对GAS5转录活性的影响。(5)利用流式细胞术和Western Blot检测过表达或沉默GAS5对肝癌细胞凋亡水平的影响。(6)焦磷酸测序技术检测LncRNA GAS5启动子区CpG岛的甲基化程度,及其与rs145204276不同基因型的关联。结果:(1)基因分型结果显示,位于LncRNA GAS5基因启动子区的rs145204276位点具有较好的多态性,正常对照组中rs145204276位点5bp插入/缺失(Ins/Del)的基因型频率分别为0.478(Ins/Ins),0.444(Ins/Del)和0.078(Del/Del),等位基因频率分别为0.70(Ins)和0.30(Del)。其分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),表明本研究纳入的对照样本具有群体代表性。调整性别、年龄、吸烟、饮酒、HBV感染等主要风险因素后,运用Logistic回归分析的方法对实验数据进行统计分析,结果显示:基因型为Ins/Del和Del/Del的个体较基因型为Ins/Ins的个体对HCC的易感性明显增高(OR=1.23,95%CI:1.02–1.48,P<0.05;OR=2.10,95%CI:1.54–2.87,P<0.0001);等位基因分析显示,与携带Ins等位基因的个体相比,携带Del等位基因的个体对HCC的易感性增高36%(OR=1.36,95%CI:1.19–1.55,P<0.0001)。(2)Real-time PCR结果分析显示,Del/Del基因型对应HCC组织样本中LncRNA GAS5 mRNA的表达水平是Ins/Ins和Ins/Del基因型对应HCC组织样本组的2.55倍(P<0.01)。(3)双荧光素酶报告基因系统检测结果显示,在三种肝癌细胞系(Huh-7,BEL-7404和SK-HEP-1)中具有相同趋势,即转染pGL3-GAS5-WT、pGL3-GAS5-MT载体的细胞组荧光素酶活性均显著高于转染pGL3-basic空载的细胞组荧光素酶活性;转染pGL3-GAS5-MT载体的细胞组荧光素酶活性高于转染pGL3-GAS5-WT的细胞组荧光素酶活性。(4)流式细胞术检测结果显示,在过表达LncRNA GAS5的肝癌细胞组中,其凋亡率显著低于对照组(36.52±0.97%vs.47.95±1.26%,P<0.001);Western Blot实验结果显示,过表达GAS5的肝癌细胞中caspase 3(细胞凋亡相关蛋白)的表达水降低,而Bcl-2(细胞生存相关蛋白)的表达水平升高;沉默GAS5后,其抑制肝癌细胞凋亡的作用被部分减弱。(5)焦磷酸测序检测CpG岛的甲基化程度结果表明,LncRNA GAS5启动子区的第七个CpG岛(与rs145204276多态位点相邻)的平均甲基化指数,基因型为Del/Del的个体显著高于Ins/Del或Ins/Ins基因型个体(Del/Del基因型:41.3%,Ins/Del基因型:24.6%,Ins/Ins基因型:21.1%;P<0.01)。结论:(1)中国汉族人群中rs145204276多态与HCC易感性存在显著关联。(2)HCC组织中rs145204276多态不同基因型与对应的组织中LncRNA GAS5表达量之间存在显著的基因型-表型关联。(3)LncRNA GAS5可抑制HCC细胞凋亡。(4)rs145204276多态可能通过影响LncRNA GAS5启动子区中CpG岛的甲基化程度,从而影响LncRNA GAS5的表达,进而参与HCC的发生发展。