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本课题从丰富和可再生的油酸原料出发,使用油酸水合酶生物催化合成生物可降解性化学品10-羟基硬脂酸;同时将上述油酸水合酶与10-羟基硬脂酸脱氢酶级联,催化油酸转化直接合成更加有用的10-羰基硬脂酸。上述酶促级联反应,不仅条件温和、时空产率高,而且反应产物10-羰基硬脂酸经过进一步裂解和转化后,可以合成多种高附加值的中链二元酸、羟基酸和ω-氨基酸等功能化学品。本课题的研究内容主要分为以下三个部分:(1)油酸水合酶的筛选。以已报道的油酸水合酶的蛋白序列为探针,在生物数据库中挖掘、筛选潜在的油酸水合酶。从实验室保藏的菌种库和基因组数据库中挑选不同类型的菌株和基因组进行克隆,在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行异源表达,并测定其对油酸的水合能力。其中来源于Paracoccus aminophilus的油酸水合酶(简称PaOH)表现出较高的活力。(2)PaOH的表征与酶促水合反应的优化。PaOH在pH 6.5、30℃和4%(v/v)DMSO(助溶剂)的存在下展现出最高活力。在最适条件下,测得PaOH的比活力为5.21U·mg-1。PaOH的催化效率常数(kcat/KM)为10,700min-1·mM-1,是目前已知油酸水合酶中最高的。25℃与30℃下PaOH的半衰期分别为4.05 h和3.02 h。对PaOH催化的油酸水合反应的底物和催化剂上载量进行了优化,当底物上载量为90 g·L-1,酶粉加入量为10 g·L-1,反应进行4 h后,转化率达96.1%,时空产率为552 g·L-1·d-1。产品最终的分离得率为67.9%(mol/mol),纯度达99.3%。(3)水合酶与脱氢酶的级联催化反应。因为10-羟基硬脂酸脱氢酶(MlDH)的酶促反应需要昂贵的辅酶NAD+作为辅底物,所以需要构建一个辅酶循环再生的体系。经过分析比较,本文选用乳酸脱氢酶(LDH)与MlDH进行偶联,以实现辅酶的循环再生。为了使水合酶PaOH的催化能力达到最大,我们采用一锅两步的反应方式进行级联催化。在底物上载量为90 g·L-1,PaOH酶粉加入量为10 g·L-1,NAD+添加量为0.1 mM,LDH与MlDH酶粉的加入量分别为0.5 g·L-1的条件下,反应10 h后油酸转化率达95.0%。最终产品10-羰基硬脂酸的分离得率为51.9%(mol/mol),纯度达99.0%。